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면역 반응에 필요하며 면역을 조절하는 사이토카인인 종양괴사인자-알파(TNF-α)는 종양괴사인자-알파 수용체와 상호작용이 필수적이다. 휴미라와 같은 바이오시밀러 중화항체를 이용하여 종양괴사인자-알파(TNF-α)와 종양괴사인자-알파수용체(TNF-α receptor) 사이의 상호 작용을 억제하는 방법이자가 면역 질환 치료를 위하여 개발되었다. 우리는 단백질 데이터 은행과 homology modeling을 활용하는 생물정보학적 연구를 통해 휴미라 항체의 종양괴사인자-알파와 결합하는 성질을 분석하였다. 또한 우리는 단백질 데이터 은행에서 휴미라 중사슬 가변 부위(VH)와 경사슬 가변 부위(VL) 배열을 알아내고 18개의 아미노산 링커로 연결시킨 Humira single chain variable domain 항체(ScFv: Humira)를 제조하였다. 1개의 항원 결합가로 인한 Humira의 낮은 항원 결합가는 항원 결합가를 높이기 위해 Humira의 multimerization을 필요로 한다. 그러므로 우리는 dimer를 형성시키는 leucine zipper (ScZip)와 trimer를 형성시키는 isoleucine zipper (ILZ)를 연결시킴으로써 dimeric 또는 trimeric Humira ScFv를 구축하였다. Mono/di/trimeric Humira들은 대장균에서 발현시키고 Ni+-NTA-아가로스 칼럼으로 정제하였다. 세 종류의 정제된 ScFv들은 SDS-PAGE에서 각각 28.59 kDa, 33.70 kDa, 33.74 kDa으로 탐지되었으나 size-exclusion chromatography에서는 leucine zipper는 비공유결합에 의한 dimer (ScZip)형성을, isoleucine zipper는 비공유결합에 의한 trimer (ILZ) 형성을 유도함을 암시하는 28.59 kDa, 67.4 kDa, 101.22 kDa를 나타내었다. Dimeric 휴미라 ScFv (HumiraScZip)와 trimeric 휴미라 ScFv(HumiraILZ)의 종양괴사인자-알파 항원에 대한 결합력은 ELISA 및 western blot에 의해 관찰되었다. Bio-layer interferometry분석은 di/trimeric 휴미라 ScFv가 monomer보다 150~1,380배의 더 높은 결합력을 보여주었고 이는 leucine zipper와 isoleucine zipper helix의 비공유결합인 소수성 결합에 의해 di/trimerization되어 직접적으로 항원 결합력 증가를 유도할 수 있음을 제시해주고 있다.
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재료 및 방법
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References
참고문헌 (40)
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Bird RE, Hardman KD, Jacobson JW, Johnson S, Kaufman BM, Lee SM, Lee T, Pope SH, Riordan GS, and Whitlow M. 1988. Single-chain antigen-binding proteins. Science 242, 423?426.
Bondeson J and Maini RN. 2001. Tumour necrosis factor as a therapeutic target in rheumatoid arthritis and other chronic inflammatory diseases: The clinical experience with infliximab (REMICADE). Int. J. Clin. Pract. 55, 211?216.
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Brekke O and Løset GA. 2003. New technologies in therapeutic antibody development. Curr. Opin. Pharmacol. 3, 544?550.
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