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학술저널
저자정보
Jin, You-Xun (College of Pharmacy, Chungbuk National University) Yoo, Hwan-Soo (College of Pharmacy, Chungbuk National University) Kihara, Akio (Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University) Choi, Chang-Hwan (College of Pharmacy, Chungbuk National University) Oh, Seik-Wan (College of Medicine, Ewha Womans University) Moon, Dong-Cheul (College of Pharmacy, Chungbuk National University) Igarashi, Yasuyuki (Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University) Lee, Yong-Moon (College of Pharmacy, Chungbuk National University)
저널정보
대한약학회 Archives of pharmacal research : a publication of the Pharmaceutical Society of Korea Archives of pharmacal research : a publication of the Pharmaceutical Society of Korea 제29권 제11호
발행연도
2006.1
수록면
1,049 - 1,054 (6page)

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Activation of Sphingosine kinase (Sphk) increases a bioactive lipid, sphingosine 1-phosphate (S1P) and has been observed in a variety of cancer cells. Therefore, inhibition of Sphk activity was an important target for the development of anticancer drugs. As a searching tool for Sphk inhibitor, we developed fluorescent Sphk activity assay combined with high performance liquid chromatography (HPLC). Previously we established murine teraticarcinoma mutant F9-12 cells which lack S1P lyase and stably express Sphk1. By using F9-12 cells, optimal assay conditions were established as follows; $100\;{\mu}M\;of\;C_{17}-Sph\;and\;30\;{\mu}g$ protein of F9-12 cells lysate in 20 min. Sphingosine analog $C_{17}-Sph$ was efficiently phosphorylated by Sphk activity ($K_{m}:67.08\;{\mu}M,\;V_{max}\;:1507.5\;pmol/min/mg$). New product $C_{17}-S1P$ was separated from S1P in reversed-phase HPLC. In optimized conditions, 300 nM of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) increased Sphk activity approximately twice while $20\;{\mu}M$ of N,N-dimethylsphingosine (DMS) reduced 70% of Sphk activity in F9-12 cells lysate. In conclusion, we established non-radioactive but convenient Sphk assay system by using HPLC and F9-12 cells.
#Sphingosine 1-Phosphate #HPLC #Activity #Sphingosine kinase

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