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저자정보
김혜정 (인핸스드바이오) 김택민 (인천대학교) 김홍중 (인핸스드바이오) 정헌순 (인핸스드바이오) 이승호 (인천대학교)
저널정보
한국생명과학회 생명과학회지 생명과학회지 제29권 제6호
발행연도
2019.6
수록면
653 - 661 (9page)

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본 연구는 siRNA 기반 치료제등의 핵산치료제 개발에 있어서 필수적인 약물의 생체내 흡수, 분포, 대사, 배설에 대한 동태의 확인을 위해 stem-loop RT-qPCR 법을 이용하여 보다 더 정확한 시험법을 확립하고자 하였다. siRNA에 특이적인 primer와 probe를 선별하여 siRNA 정량검출 시험법을 최적화하였다. siRNA 표준시료를 이용하여 최적화된 시험법을 적용하였을 때 siRNA 표준시료에 대한 Cp 값(y)간의 선형분석 결과, 기울기 평균 -3.3, 결정계수 R2>0.99으로 확인되어 siRNA 표준시료와 Cp 값 간의 회귀성이 매우 높아 정량 분석이 가능한 시험법임을 확인하였고, 같은 표준시료를 이용한 stem-loop RT-qPCR의 검출한계(LOD)는 10 fM, 최소정량한계(LLOQ)는 100 fM이었다. 확립된 시험법의 신뢰성을 확인하기 위해 시험자를 다르게 하고, 시험법을 3회 반복하여 각각 진행한 결과, siRNA 표준시료에 대한 Cp 값(y)간의 선형분석 결과 기울기와 결정계수 R2의 재현성(slope ± -3.2, 결정계수 R2>0.99)을 확인하였고, 표준 곡선으로부터 환산된 siRNA 표준시료의 회수율(recovery ± 20%)과 완건성이 우수함을 확인하였다. 확립된 stem-loop RT-qPCR을 생체내 존재하는 약물 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 시험동물에 siRNA를 주입 후 시간별 혈액을 채취하여 확립된 시험법으로 시험을 진행하였고 약물 동태학적 분석을 통해 siRNA치료제의 혈액내의 안정성을 확인하였다. 따라서 본연구에서 개발된 stem-loop RT-qPCR분석법은 정확성, 정밀성 및 민감도가 높은 분석법으로 핵산치료제 개발 연구의 다양한 생체시료 분석 연구에 적용할 수 있을 것으로 기대한다.
#Bioanalysis #pharmacokinetics #siRNA therapeutics #stem-loop RT-qPCR #validation

목차

서론
재료 및 방법
결과 및 고찰
References
초록

참고문헌 (19)

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Burnett, J. C., Rossi, J. J. and Tiemann, K. 2011. Current progress of siRNA/ shRNA therapeutics in clinical trials. Biotechnol. J. 6, 1130-1146. google schola Cejka, D., Losert, D. and Wacheck, V. 2006. Short interfering RNA (siRNA): tool or therapeutic? Clin. Sci. 110, 47-58. google schola Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Doss, C. G. P. and Lee, S. S. 2017. Therapeutic miRNA and siRNA: Moving from bench to clinic as next generation medicine. Mol. Ther. Nucleic Acids 8, 132-143. google schola Chen, C. 2005. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, 79-79. google schola Fan, A. C., Goldrick, M. M., Ho, J., Liang, Y., Bachireddy, P. and Felsher, D. W. 2008. A quantitative PCR method to detect blood microRNAs associated with tumorigenesis in transgenic mice. Mol. Cancer 7, 74. google schola

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