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페닐케톤뇨증은 상염색체 열성으로 유전되며, phenylalanine-4-hydroxylase (PAH, EC 1.14.16.1)의 돌연변이에 의해 효소 불활성화를 초래하는 질환이다. 최근 유전자 재조합된 phenylalanine ammonia-lyse (PAL)에 의한 효소 대체요법이 보고된 바 있다. 이 효소를 경구용 약제로 개발하기 위하여 효소활성을 나타내기 위한 최적 조건들을 알아야 하며, 위장관내 소화효소에 의해 분해되지 않는 구조적 안정성을 유지하여야 한다. 따라서 본 연구에서는 PAL의 생화학적 특성을 규명하고, 이를 바탕으로 위장관내 소화효소로부터 저항할 수 있는 변이형들을 만들고자 하였으며, 이러한 구조적 변화를 통하여 효소의 특이 활성도가 유지될 수 있는지를 보고자 하였다. PAL의 특이 활성도를 측정하였고, 효소 활성을 나타내기 위한 최적 pH, 온도 변화에 따른 효소 활성도, 단백분해효소에 의한 활성도 변화를 측정하였다. PAL의 Vmax는 페닐알라닌과 티로신에 대하여 각각 1.77, 0.47 μ㏖/ ㎎ x protein로 나타났으며, Km은 페닐알라닌에 대하여 4.77×10?⁴ M, 티로신에 대하여 4.37×10?⁴ M로 나타났다. 또한 pH 8.5에서 가장 높은 활성을 나타내었는데, 이는 소장의 평균 pH와 유사하다. PAL의 효소 활성은 -80℃에서 5개월 동안 유지되었으며, 4℃에서 1주일 동안 93.4%의 활성을 유지하였다. PAL은 키모트립신에 의해 쉽게 분해되었으며, 이보다 약한 정도로 트립신, elastase, carboxypeptidase A, B에 의해 분해되었다. 췌장 소화효소에 대한 저항성을 증가시키기 위하여 트립신, 키모트립신 절단부위 아미노산을 변이시켜 유전자 변이형을 만들었고, 효소 활성도를 측정하였다. 6개의 유전자 변이형은 모두 저하된 효소 활성도를 나타내었는데, Y110H는 0.084, Y110A와 Y110L은 0, R123A는 0.11, R123H는 0.074, R123Q는 0.033으로 나타났다. 이러한 결과는 트립신 및 키모트립신 절단부위 아미노산이 PAL의 효소 활성에 필수적인 역할을 하고 있음을 나타낸다. PAL 변이형은 단백분해작용으로부터 보호할 수 있는 전처치 방법이지만, 페닐알라닌을 효과적으로 저하시키기 위해서 효소활성을 유지할 수 있는 다음 단계의 처치가 필요하다.
목차
Introduction
Materials and Methods
Results
Discussion
References
초록
참고문헌 (24)
참고문헌 신청
1. [학술지(정기간행물)] - Abell, C. W / 1987 / Phenylalanine ammonia-lyase from the yeast Rhodotorula glutinis / Methods Enzymol. 142 : 242 ~ 249
2. [학술지(정기간행물)] - Anson, J. G. / 1987 / Complete nucleotide sequence of the Rhodosporidium toruloides gene coding for phenylalanine ammonia-lyase / Gene 58 : 189 ~ 199
3. [학술지(정기간행물)] - Bourget, L / 1986 / Phenylalanine ammonia-lyase immobilized in microcapsules for the depletion of phenylalanine in plasma in phenylketonuric rat model / Biochim. Biophys. Acta 883 : 432 ~ 438
4. [학술지(정기간행물)] - Bourget, L. / 1989 / Effects of oral administration of artificial cells immobilized phenylalanine ammonia-lyase on intestinal amino acids of phenylketonuric rats / Biomater. Artif. Cells Artif. Organs. 17 : 161 ~ 181
5. [학술지(정기간행물)] - Brannigan, J. A / 2002 / Protein engineering 20 years on / Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 : 964 ~ 970
2. [학술지(정기간행물)] - Anson, J. G. / 1987 / Complete nucleotide sequence of the Rhodosporidium toruloides gene coding for phenylalanine ammonia-lyase / Gene 58 : 189 ~ 199
3. [학술지(정기간행물)] - Bourget, L / 1986 / Phenylalanine ammonia-lyase immobilized in microcapsules for the depletion of phenylalanine in plasma in phenylketonuric rat model / Biochim. Biophys. Acta 883 : 432 ~ 438
4. [학술지(정기간행물)] - Bourget, L. / 1989 / Effects of oral administration of artificial cells immobilized phenylalanine ammonia-lyase on intestinal amino acids of phenylketonuric rats / Biomater. Artif. Cells Artif. Organs. 17 : 161 ~ 181
5. [학술지(정기간행물)] - Brannigan, J. A / 2002 / Protein engineering 20 years on / Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 : 964 ~ 970
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