갓김치에서 분리한 NaCl과 캡사이신 내성세균인 Bacillus amyloliquefaciens G-13의 혈전용해활성 : 피브린 평판분석과 피브린 자이모그래피를 사용한 활성에 대한 연구 :Fibrinolytic activities of NaCl- and capsaicin-resistant Bacillus amyloliquefaciens G-13 Isolated from Mustard Leaf Kimchi: studies of the activities using Fibrin plate assay and Fibrin Zymography

이현호

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자료유형: 학위논문

저자정보: 이현호 (순천향대학교, 순천향대학교 대학원)

지도교수: 오계헌

발행연도: 2021

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이 논문의 연구 히스토리 (3)

2021

갓김치에서 분리한 NaCl과 캡사이신 내성세균인 Bacillus amyloliquefaciens G-13의 혈전용해활성 : 피브린 평판분석과 피브린 자이모그래피를 사용한 활성에 대한 연구

이현호 생명공학과 2021.01 학위논문

2020

피브린 Zymographic Gel에서 Bacillus amyloliquefaciens G-13으로부터 혈전용해효소의 생성에 영향을 미치는 물리화학적 요인들의 비교

이현호 , 차민지 , 오계헌 KSBB Journal 2020.09 학술저널

2019

갓김치에서 분리한 NaCl 및 캡사이신 내성 세균인 Bacillus amyloliquefaciens G-13의 혈전용해활성

이현호 , 석지원 , 오계헌 KSBB Journal 2019.09 학술저널

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본 연구는 발효된 갓김치로부터 NaCl과 캡사이신에 내성이 있는 균주인 Bacillus amyloliquefaciens G-13을 분리하여 고농도의 NaCl과 캡사이신 하에서 피브린 평판분석과 피브린 zymography를 사용하여 혈전용해 활성을 알아보고자 수행되었다. 먼저 균주 G-13의 생리생화학적 특성조사를 실시하였다. 16S rRNA 분석을 통하여 이 균주를 동정하였으며, 이 균주는 B. amyloliquefaciens G-13로 명명하였다. 분리 세균의 생장과 혈전용해 활성의 변화를 배양기간에 따라 모니터링 하였다. B. amyloliquefaciens G-13은 다양한 NaCl (1-10%)과 캡사이신 (0-300 μg/mL) 농도에서 잘 생장하였다. NaCl과 캡사이신이 없는 상태에서 혈전용해 활성은 3.42 unit/mL의 높은 활성을 보여주었으며, 본 연구에서 수행된 고농도의 NaCl (10%)와 캡사이신 (300 μg/mL)이 동시에 포함된 배지에서도 84시간에 최대 0.74 unit/mL의 활성을 보여주었다. 주사전자현미경 분석은 NaCl (5-10%) 또는 capsaicin (500-1,000 μg/mL)을 6시간 동안 처리한 후 표준으로 사용된 Bacillus sp. HK-15의 표면에서 중요한 형태학적 변화를 보여주었다. 그러나 동일한 농도의 NaCl 또는 capsaicin 노출 하에서 B. amyloliquefaciens G-13 세포의 표면에서 거의 형태학적 변화는 관찰되지 않았다. 본 연구에서는 균주 G-13의 혈전용해효소에 대한 다양한 물리화학적 요인들이 미치는 영향 (예, 온도, pH, NaCl, capsaicin, 금속 이온, 저해제)을 조사하는 연구로 확대하였다. 먼저 G-13 균주의 혈전용해 활성의 시간 경로에 따른 혈전용해 활성의 패턴을 fibrin plate assay로 측정하였으며, 배양 84시간 후, 최대 혈전용해 활성은 표준으로 사용되는 plasmin의 활성보다 약 3.42배 높았다. 피브린 zymography를 통해, G-13 균주로부터의 혈전용해 효소의 4개 밴드 (23, 34, 45, 67 kDa)를 피브린 zymography 젤(gel)에서 조사하였다. 이 균주는 각각 NaCl (0-10%) 또는 캡사이신 (0-300 μg/mL)의 존재 하에서 생장하며, 혈전용해 효소를 생산할 수 있었다. 효소 활성을 위한 최적 pH와 온도는 각각 8과 35°C였다. 금속 이온의 혈전용해 활성을 조사한 결과, K+, Ca2+, Mg2+ 이온은 전반적으로 증가하여 유지되었으나, Fe3+, Zn2+, Ba2+, Hg2+ 이온은 혈전용해효소의 활성을 급격히 감소시켰다. 이 효소는 phenylmethanesulfonyl fluroide (PMSF)에 의해 완전히 저해되어 serine protease인 것으로 확인되었다. 이들 결과는 B. amyloliquefaciens G-13의 혈전용해 효소에 대한 다양한 물리화학적 요인에 대한 영향을 피브린 zymography를 통해 확인하여, 혈전용해효소 생성세균들의 특성을 이해하는데 중요한 단서를 제공한다.

The purpose of this work was to investigate fibrinolytic activities of NaCl- and capsaicin-resistant Bacillus amyloliquefaciens G-13 isolated from mustard leaf kimchi using fibrin plate assay and fibrin zymography. Initially, the physiological and biochemical characteristics of strain G-13 were examined. 16S rRNA sequencing analysis was performed to identify the strain, and the strain was designated as B. amyloliquefaciens G-13. B. amyloliquefaciens G-13 grew well in the different concentrations of NaCl (1-10%) and capsaicin (0-300 μg/mL) at 37C. B. amyloliquefaciens G-13 showed the strongest fibrinolytic activity (3.42 unit/mL) in the absence of NaCl and capsaicin. When B. amyloliquefaciens G-13was cultivated in harsh conditions, such as in LB media containing 10% NaCl and 300 ug/mL capsaicin, the culture showed 0.74 unit/mL of fibrinolytic activity for 84 h. Scanning electron microscopic analysis demonstrated the significant morphological changes on the surface of the Bacillus sp. HK-15 cells used as standard after treatment with NaCl (5-10%) or capsaicin (500-1,000 μg/mL) for 6 h. However, almost no morphological changes were observed on the surfaces of the B. amyloliquefaciens G-13 cells under the same concentrations of NaCl or capsaicin, respectively. In this study, we extended the work to the comparison of various physicochemical factors (e.g., temperature, pH, NaCl, capsaicin, metal ions, and inhibitors) influencing the production of fibrinolytic enzyme strain G-13. Time course of the fibrinolytic activity of strain G-13 was measured by the fibrin plate assay, and after 84 hours of incubation, the maximum fibrinolytic activity was about 3.42 times that of plasmin used as the standard. Through a fibrin zymographic assay, four bands (23, 34, 45, and 67 kDa) of fibrinolytic enzyme from strain G-13 were compared in fibrin zymographic gels. The strain could grow and produce the fibrinolytic enzyme in the presence of NaCl or capsaicin, respectively. The optimum pH and temperature for the enzymatic activity were 8 and 35 °C. In the study of the effects of metal ions on fibrinolytic activity, K+, Ca2+, and Mg2+ ions increased the activity and maintained it overall, but Fe3+, Zn2+,Ba2+, and Hg2+ ions rapidly decreased the activity of the fibrinolytic enzyme. The enzyme was completely inhibited by phenylmethylsulfonic acid (PMSF), suggesting that it was a serine protease. These results provide important clues for understanding the characteristics of fibrinolytic bacteria by confirming the effects of B. amyloliquefaciens G-13 on various physicochemical factors influencing the production of fibrinolytic enzymes through fibrin zymography.

#갓김치 #NaCl #캡사이신 #피브린 #자이모그래피

Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 재료 및 방법 10
1. 균주의 확보 및 배양조건 10
2. 분리세균의 형태학적 관찰 및 생화학적 특성조사 10
3. 분리세균의 16S rRNA 염기서열에 의한 동정 및 계통수 분석 11
4. NaCl 농도와 캡사이신 농도에 따른 분리세균의 생장 측정 12
5. NaCl과 캡사이신 농도에 따른 EPS 생성의 변화 13
6. NaCl 및 캡사이신 농도에 따른 세포 외부형태의 변화 13
7. 피브린 평판법을 통한 혈전용해활성 측정 14
8. 피브린 자이모그래피 15
(1) 시료 준비 15
(2) SDS-PAGE 및 효소의 복원과 활성화 15
(3) Staining 및 밀도분석 15
9. 배양시간에 따른 혈전용해활성 조사 16
10. 물리화학적 요인에 따른 혈전용해활성 변화 16
(1) NaCl 농도에 따른 활성 변화 16
(2) 캡사이신 농도에 따른 활성 변화 17
(3) 온도 변화에 따른 활성 변화 17
(4) pH 변화에 따른 활성 변화 17
(5) 저해제에 따른 활성 변화 18
(6) 금속이온 변화에 따른 활성 변화 18
Ⅲ. 결과 19
1. 균주 분리 및 배양 19
2. 분리세균의 16S rRNA 염기서열에 의한 동정 및 계통수 분석 21
3. 분리세균의 형태학적 관찰 및 생화학적 특성조사 23
4. NaCl 농도에 따른 분리세균의 생장 25
5. 캡사이신 농도에 따른 분리세균의 생장 27
6. NaCl 및 캡사이신 농도에 따른 분리균주의 생장 29
6-1. 5% NaCl과 캡사이신 농도에 따른 분리균주의 생장 29
6-2. 10% NaCl과 캡사이신 농도에 따른 분리균주의 생장 31
7. NaCl 및 캡사이신 농도에 따른 EPS 생성 33
7-1. NaCl 농도에 따른 EPS 생성의 변화 33
7-2. 캡사이신 농도에 따른 EPS 생성의 변화 35
7-3. 병용된 NaCl과 캡사이신 농도에 따른 EPS 생성 37
8. NaCl 및 캡사이신 농도에 따른 세포 외부형태의 변화 39
8-1. NaCl 농도에 따른 세포 외부형태의 변화 39
8-2. 캡사이신 농도에 따른 세포 외부형태의 변화 41
9. NaCl 및 캡사이신 농도에 따른 혈전용해활성 43
9-1. NaCl 농도에 따른 혈전용해효소의 활성 43
9-2. 캡사이신 농도에 따른 혈전용해효소의 활성 45
9-3. 병용된 NaCl과 캡사이신 농도에 따른 혈전용해활성 47
10. 배양시간에 따른 혈전용해활성 50
11. 물리화학적 요인에 따른 혈전용해활성변화 52
11-1. NaCl 농도에 따른 활성변화 52
11-2. 캡사이신 농도에 따른 활성변화 54
11-3. 온도 변화에 따른 활성변화 56
11-4. pH 변화에 따른 활성변화 58
11-5. 저해제에 따른 활성변화 60
11-6. 금속이온에 따른 활성변화 62
Ⅳ. 고찰 64
Ⅴ. 결론 72
Ⅵ. 참고문헌 74
Abstract 82

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