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알칼리성 단백질 분해효소 고생산 돌연변이 균주 Vibrio metschnikovii L12-23, N4-8, KS1으로부터 알칼리성 단백질 분해효소를 암호화하는 vapK (Vibrio alkaline protease K) 유전자들을 PCR에 의하여 분리한 다음 DNA shuffling, error-prone PCR 방법과 같은 분자진화 기술을 통해 고활성 단백질 분해효소를 생산하는 재조합 V. metschnikovii 균주를 제작하였다. DNA shuffling 방법을 통해 변형시킨 vapK-1 유전자와 이 유전자를 주형으로 error-prone PCR 기법을 통해 재 변형된 vapK-2 유전자를 cloning한 후 V. metschnikovii KS1 균주에 역도입하여 재조합 균주를 제조하였다. 재조합 균주들의 단백질 분해 능력을 조사한 결과 vapK-2 유전자가 2copy 도입된 재조합 균주의 경우 야생형 균주인 V. metschnikovii RH530에 비해 43.6배 높은 단백질 분해활성을 보였으며 숙주인 V. metschnikovii KS1에 비해 약 3.9배 향상된 단백질분해 활성을 확인할 수 있었다. 변형된 vapK-1과 vapK-2 유전자를 야생형 vapK 유전자의 염기서열을 비교ㆍ분석한 결과 단백질 분해 능력의 활성에 영향을 미치는 active site를 제외한 부분에서 변화가 일어났음을 확인 할 수 있었다. 변형된 유전자 vapK-1을 two copy를 포함한 재조합 플라스미드를 가진 V. metschnikovii KS1을 30 L fermentor로 배양 하였을 때 배양 후 35 시간에 18,000 PU/㎖의 활성을 보였으며, 이는 향후 산업용 균주로서 사용될 수 있는 가능성을 제시하였다.
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재료 및 방법
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참고문헌
참고문헌 (18)
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Anwar, A. / 1998 / Alkaline proteases: a review / Bioresour. Technol 64:139~144
Banerjee, U.C. / 1999 / Thermostable alkaline protease from Bacillus brevis and its characterization as a laundry detergent additive / Proc. Biochem 35:213~219
Chung, S.S. / 2000 / Isolation of high yielding alkaline protease mutants of Vibrio metschnikovii strain RH530 and detergency properties of enzyme / J. Microbial. Biotechnol 10:349~354
Chung, S.S. / 2001 / Molecular characterization of gene encoding an extracellular alkaline protease in Vibrio metschnikovii / Biotechnol. Lett 23:1175~1182
Chung, S.S. / 2001 / Transformation of an alkaline protease overproducer, Vibrio metschnikovii strain RH530, and improvement of plasmid stability by the par locus / J. Microbiol. Bioltechnol. 11:222~228
Banerjee, U.C. / 1999 / Thermostable alkaline protease from Bacillus brevis and its characterization as a laundry detergent additive / Proc. Biochem 35:213~219
Chung, S.S. / 2000 / Isolation of high yielding alkaline protease mutants of Vibrio metschnikovii strain RH530 and detergency properties of enzyme / J. Microbial. Biotechnol 10:349~354
Chung, S.S. / 2001 / Molecular characterization of gene encoding an extracellular alkaline protease in Vibrio metschnikovii / Biotechnol. Lett 23:1175~1182
Chung, S.S. / 2001 / Transformation of an alkaline protease overproducer, Vibrio metschnikovii strain RH530, and improvement of plasmid stability by the par locus / J. Microbiol. Bioltechnol. 11:222~228
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