가물치(Channa argus) 젖산탈수소효소 동위효소들의 정제 및 특성

Eun Mi Park; Jung Joo Yum

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자료유형: 학술저널

저자정보: Eun Mi Park Jung Joo Yum (청주대학교)

저널정보: 한국생명과학회 생명과학회지 생명과학회지 제20권 제2호

발행연도: 2010.2

수록면: 260 - 268 (9page)

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가물치(Channa argus) 조직의 젖산탈수소효소 동위효소(EC 1.1.1.27, lactate dehydrogenase, LDH)를 정제하고 생화학적, 면역학적 및 역학적 방법으로 특성을 연구하였다. LDH 활성은 골격근이 380.4 units로 가장 높고 심장 13.4, 눈 3.5, 뇌 조직 5.4 units이었으며, 심장의 CS 활성은 20.7 unit로 가장 높고, LDH/CS는 골격근 172.9, 심장 0.6, 눈 0.32, 뇌 0.47이고, 단백질 양은 골격근 14.7 ㎎/g이며, 특이활성(units/mg)은 골격근 25.88, 심장 0.79, 눈 0.31, 뇌 1.38 units/㎎이었으므로 골격근은 혐기적이고, 심장은 호기적이었다. LDH A₄, B₄, eye-specific C₄에 대한 항혈청을 사용한 Western blot, 면역침강반응 및 native- polyacrylamide gel electrophoresis에 의해 A₄, A₃B, A₂B₂, AB₃ 및 B₄가 모든 조직에서 확인되었고, 눈 조직에서 C₄와 AC₃, A₂C₂, AC₃, 뇌 조직에서 A₃C도 확인되었다. LDH A₄, A₃B, A₂B₂, AB₃, B₄, eye-specific C₄ 동위효소는 affinity chromatography와 Preparative PAGE Cell에 의해 정제되었다. LDH A₄ 동위효소는 NAD+ 유입 후 정제되었고, eye-specific C₄는 A₄에 이어 용출되기 시작하였으며 B₄는 buffer 유입 후 용출되었다. 정제한 결과 A₄는 B₄ 및 eye-specific C₄와 분자구조의 일부가 유사하였지만 B₄와 C₄는 서로 다른 것으로 나타났으므로, 하부단위체 A는 보존적이고, 하부단위체 B는 A보다 더 빠르게 진화된 것으로 보인다. 피루브산 10 mM에서 A₄ 동위효소 39.98%, A₂B₂ 21.28%, B4 19.67% 및 eye-specific C₄16.87%의 활성이 남아있었고, 피루브산에 대한 Km<SUP>PYR</SUP>은 A₄ 0.17 mM, B4 0.27 mM, eye-specific C₄ 0.133 mM였다. A₄, B₄, eye-specific C₄, A₂B₂, A₃B 및 AB₃의 최적 pH는 각각 pH 6.50, pH 8.5, pH 5.5, pH 6.0-6.5, 5.0 및 pH 7.5였고, 동질사량체 A₄와 이질사량체 동위효소들은 넓은 pH 영역에서 안정하였다. 특히 골격근은 LDH 활성이 크므로 활동성이 크며, 눈조직에서 피루브산 친화력이 강한 eye-specific C₄에 의해 피루브산 대사가 빠르게 일어나고, 이어서 A₄에 의해 젖산이 산화되어지는 것으로 사료되므로, 종의 생태환경 및 먹이 획득 양식에 따라 LDH-C 발현, 기질에 대한 친화도 및 대사 시간이 다른 것으로 사료된다.

The lactate dehydrogenase (EC 1.1.1.27, LDH) isozymes in tissues from Channa argus were purified and characterized by biochemical, immunochemical and kinetic methods. The activity of LDH in skeletal muscle was the highest at 380.4 units and those in heart, eye and brain tissues were 13.4, 3,5 and 5.4 units, respectively. Citrate synthase (EC 4.1.3.7, CS) activity in heart tissue was the highest at 20.7 units. LDH/CS in skeletal muscle, heart, eye and brain tissues were 172.9, 0.6, 0.32 and 0.47. Protein concentration in skeletal muscle tissue was 14.7 ㎎/g and specific activities of LDH in skeletal muscle, heart, eye and brain tissues were 25.88, 0.79, 0.31 and 1.38 units/㎎, respectively. Therefore, skeletal muscle tissue was anaerobic and heart tissue was aerobic. The LDH isozymes in tissues were identified by polyacrylamide gel electrophoresis, immunoprecipitation and Western blot with antiserum against A₄, B₄, and eye-specific C₄. LDH A₄, A₃B, A₂B₂. AB₃ and B₄ isozymes were detected in every tissue, C4, AC₃, A₂C₂ and A₃C were detected in eye tissue, and A₃C was found in brain tissue. LDH A₄, A₃B, A₂B₂, AB₃, B₄, eye-specific C₄ isozymes were purified by affinity chromatography and Preparative PAGE Cells. The LDH A₄ isozyme was purified in the fraction from elution with NAD+containing buffer of affinity chromatography. Eye-specific C₄ isozyme was eluted right after A₄, after which B₄ isozyme was eluted with plain buffer. As a result, one part of molecular structures in A₄, B₄ and eye-specific C₄ were similar, but were different from each other in B₄ and C₄. Therefore the subunit A may be conservative in evolution, and the evolution of subunit B seems to be faster than that of subunit A. The activity of LDH A₄, A₂B₂, B₄, and eye-specific C₄ isozymes remained at 39.98, 21.28, 19.67 and 16.87% as a result of the inhibition by 10 mM of pyruvate, so the degree of inhibition was very high. The Km<SUP>PYR</SUP> values were 0.17, 0.27 and 0.133 mM in A₄, B₄ and eye-specific C₄ isozymes, respectively. The optimum pH of LDH A₄, B₄, eye-specific C₄, A₂B₂, A₃B, and AB₃ were pH 6.5, pH 8.5, pH 5.5, pH 6.0-6.5, pH 5.0 and pH 7.5. The A₄ and heterotetramer isozymes stabilized a broad range of pH. Especially, LDH activities in skeletal muscle tissue were high, resulting in a high degree of muscle activity.LDH metabolism in eye tissue seems to be converted faster from pyruvate to lactate by eye-specific C₄ isozyme as eye-specific C₄ have the highest affinity for pyruvate, and right after the conversion, oxidation of lactate was induced by A₄ isozyme. It was found that expression of Ldh-C, affinity to substrate and reaction time of C₄ isozyme were different according to the ecological environmental and feeding capturing patterns.

#Channa argus #lactate dehydrogenase isozyme #eye-specific C₄ isozyme #Km #Vmax

참고문헌 (37)

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2. [학술지(정기간행물)] - Ahmad, R. / 2005 / Ontogenetic changes and developmental adjustments in lactate dehydrogenase isozymes of an obligate air-breathing fish Channa punctatus during deprivation of air access / Comp. Biochem. Physiol. B 140 : 271 ~ 278

3. [학술지(정기간행물)] - Almeida-Val, V. M. F. / 1993 / Evolutionary trends of LDH isozymes in fishes / Comp. Biochem. Physiol. B 105 : 21 ~ 28

4. [단행본] - Almeida-Val, V. M. F. / 1995 / Air-breathing fishes: metabolic bio- chemistry of the first diving vertebrates. in: Biochemistry and molecular biology of fishes / Elsevier Science : 45 ~ 55

5. [단행본] - Almeida-Val V. M. F. / 1999 / Increase of anaerobic potential during growth of an Amazonian cichlid, Astronotus ocellatus. Survivorship and LDH regulation after hypoxia exposure. in: Biology of Tropical Fishes / INPA : 437 ~ 448

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