Anti-stress (Relaxation) and Gut Microbiota Mediated Mechanism of Psychobiotic Limosilactobacillus reuteri Fermented Brown Rice :Limosilactobacillus reuteri를 이용한 발효 현미의 항불안 효능 및 장내 균총에 미치는 영향

Akanksha Tyagi

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자료유형: 학위논문

저자정보: Akanksha Tyagi (강원대학교, 강원대학교 대학원)

지도교수: Deog-Hwan Oh

발행연도: 2023

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이 논문의 연구 히스토리 (3)

2023

Anti-stress (Relaxation) and Gut Microbiota Mediated Mechanism of Psychobiotic Limosilactobacillus reuteri Fermented Brown Rice

Akanksha Tyagi 식품환경융합학과 2023.01 학위논문

2022

Probiotic Lactobacillus reuteri Fermented Brown Rice Attenuates Anxiety-related Behavior and Modulates Gut Microbiota in Mice Model

Akanksha Tyagi , Deog-Hwan Oh 한국식품영양과학회 학술대회발표집 2022.10 학술대회자료

2021

Novel Antioxidant Peptides Derived from Brown Rice Fermented by Limosilactobacillus reuteri and Their Cytoprotective effects on In-vitro Radical Assays and Ex-vivo H₂O₂-induced Oxidative Stress

Akanksha Tyagi , Deog-Hwan Oh 한국식품영양과학회 학술대회발표집 2021.10 학술대회자료

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장내 균총은 장-뇌축을 따라 양방향 커뮤니케이션을 통해 뇌의 생리 기능과 행동을 조절하는 역할을 담당하고 있음이 최근 많은 연구를 통해 밝혀지고 있다. 따라서 본 연구에서는 프로바이오틱스 균주 Limosilactobacillus reuteri (L.reuteri)를 이용한 발효현미의 장내 균총 조절, 스트레스 행동 및 기억력 개선 효능을 만성 스트레스 마우스 모델에서 수행하였다.
다양한 쌀 품종을 기능적 활성과 대사산물에 근거하여 스크리닝하여 가장 우수한 현미 품종(GR)을 선별하였다. 그 후, PCR을 통한 GAD 유전자 검출과 전체 게놈 분석을 이용하여 기능성 유산균주를 스크리닝·동정하였다. 또한 HPLC 및 UHPLC-Q-TOF 분석을 통해 대사 산물을 스크리닝하여 L.reuteri 균주가 psychobiotic 임을 확인하였다. 추가 연구를 진행하기 위해 선별된 현미에 L.reuteri를 접종하여 발효를 진행했으며 in vitro, metabolomics 및 세포주 실험을 통해 발효현미(FBR)의 기능성을 평가하였다. 마지막으로, ICR 마우스를 사용한 만성 스트레스 모델을 확립하고, 마우스 그룹 (control (no stress), stressed, stressed + fermented brown rice / FBR, stressd + drug)별 행동 변화 특성화 테스트를 진행하였다.
만성 스트레스 마우스 모델에 FBR(100 mg/kg, 500 mg/kg)을 경구 투여한 결과 장기간 공간 학습 기억력이 향상되었고 이로인해 불안으로 인한 행동적 스트레스를 줄일 수 있었다.
NGS 및 대변 미생물 16S rRNA 분석을 통해 스트레스를 받은 그룹에서는 미생물 풍부도과 미생물 다양성이 크게 감소하였지만, 스트레스 그룹에 발효현미(FBR)를 4주간 급여한 결과 장내 미생물의 풍부도와 다양성이 개선됨을 확인하였다. 스트레스 그룹 마우스에 발효현미(FBR) 급여 후 Firmicutes: Bacteroidetes 비율이 42:13에서 62:34로 크게 개선되었으며 아미노산 대사, 에너지 대사, SCFA 생산 박테리아 군의 수준이 크게 증가하였고 Acinetobacter, proteus, Bacillus, Enterococcus 를 포함한 잠재적 병원성 proteobacteria 문의 개체수는 감소함을 확인하였다. 또한 발효현미(FBR) 샘플은 세로토닌과 GABA와 같은 신경전달물질의 증가, 스트레스 호르몬의 코르티코스테론과 IL-6, 10, TNFα 등의 염증성 사이토카인의 감소를 보였다. 본 실험의 결과는 프로바이오틱스를 포함한 발효식품과 함께 신바이오틱스로 알려진 발효식품이 유익한 효과를 높이고 장내 균총을 건강한 상태로 조절함으로써 신경전달물질, SCFA, 장내 대사산물과 상호작용하기 때문에 불안과 우울증과 같은 스트레스에 대한 보호 효과가 있을 수 있음을 시사한다.

A growing body of evidence suggests that gut microbiota play a role in modulating brain physiology and behaviour via bidirectional communication along the gut-brain axis. Thus, our study used probiotic Limosilactobacillus reuteri (L.reuteri) fermented brown rice to modulate gut microbiota composition, stress behaviour, and memory improvement in chronically stressed mice. Various rice varieties were screened based on functional activity and metabolites, and the best brown rice variety (GR) was selected. Secondly, we screened & identified the functional Lactic acid strain using GAD gene detection by PCR and its whole genome analysis. We have also screened bacterial metabolites to confirm our strain is psychobiotic by HPLC & UHPLC- Q-TOF approaches. Later, materials were fermented with the selected L.reuteri for further research, and their fermentation efficacy was also screened using in vitro, metabolomics and cell line assays. Finally, a chronic mild stress model using ICR mice was established, and mice groups (control (no stress), stressed, stressed + fermented brown rice/FBR, stressed + drug) were administered and underwent a battery of tests to characterize their behavioural changes. Oral administration of 100 mg/kg and 500 mg/kg body weight of FBR was able to reverse the behavioural despair brought on by anxiety with memory improvement in long-term spatial learning. Next-generation sequencing and analysis of faecal microbial 16S rRNA revealed significant microbial richness and diversity reduction in the stressed group. However, stressed mice fed with FBR for four weeks had improved gut microbial richness and diversity. FBR feeding significantly improved the Firmicutes: Bacteroidetes ratio of the stressed group from 42:13 to 62:34. The level of amino acid metabolism, energy metabolism, SCFAs producing bacterial groups significantly increased while the population of potential pathogenic phylum proteobacteria containing Acinetobacter, proteus, Bacillus and Enterococcus decreased after FBR feeding. FBR feeding also showed an increase in neurotransmitters like Serotonin and GABA and a decrease in the stress hormone corticosterone and inflammatory cytokines like IL-6, 10 and TNFα. Our results suggest that fermented foods that contain probiotics and, together, known as synbiotics, may have a protective effect against stress like anxiety or depression as they can interact with neurotransmitters, SCFAs and gut metabolites by enhancing beneficial effects and modulating gut microbiota towards a healthy state.
Keywords: Stress, Metagenomics, Metabolomics, SCFAs, Brown rice, Gut-brain axis, anxiolytic, fermentation

#스트레스 #Metagenomics #Metabolomics #SCFAs #현미 #장-뇌 축 #항불안제 #발효

ABSTRACT i
CONTENTS v
LIST OF TABLES x
LIST OF FIGURES xi
ABBREVIATIONS xiii
I. General Introduction 1
II. Literature Review 5
2.1. Stress and its Causes 6
2.1.1. How Does Stress Contribute to the Development of Anxiety? 9
2.1.2. The Impact of Prolonged Stress and Anxiety Disorder on Health 12
2.1.3. How does Stress Contribute to the Development of Depression? 14
2.1.4. The Interplay Between Stress, Cognitive Function, and Learning 16
2.2. A Comprehensive Overview of the Microbiome 18
2.3. The Interplay Between Stress and the Microbiota 20
2.3.1. The Interplay Between Gut Microbiota and Stress Circuitry 21
2.3.2. Role of Gut Microbiota in Anxiety-like Behaviour 22
2.3.3. Role of Gut Microbiota in Cognitive Impairment 23
2.4. Psychobiotics: A Promising Class of Psychotropic 24
2.4.1. Effect of Psychobiotics on Stress-related Disorders & Cognitive Process 25
2.5. Unlocking the Impact of Neuroactive Compounds 26
2.5.1. Impact of GABA & GABAergic Signaling 27
2.5.2. Impact of Serotonin & Serotonergic Signaling 28
2.5.3. Impact of Food-derived Bioactive Peptides 29
2.6. Role of Vagus Nerve in Neuromodulation 30
2.7. Mental Health Benefits of Foods Fermented with Psychobiotics 31
III. Screening and Characterization of Different Brown Rice Varieties using in vitro and UHPLC-ESI-TOF-MS/MS Approaches 34
3.1. Abstract 35
3.2. Introduction 36
3.3. Materials and Methods 37
3.3.1. Brown Rice Samples 37
3.3.2. Chemical and Cultures 39
3.3.3. Preparation of Rice Samples Ethanoic Extracts 40
3.3.4. Quantification of the Total Anthocyanin Content (TAC) 40
3.3.5. Measurement of Total Phenolic Content (TPC) 40
3.3.6. Measurement of Total Flavonoid Content (TFC) 40
3.3.7. Estimation of Antioxidant Potential of Various Rice Varieties 41
3.3.7.1. DPPH Radical Scavenging Activity 41
3.3.7.2. Assessment of ABTS Radical Scavenging Activity 41
3.3.7.3. Ferric-Reducing Antioxidant Power (FRAP) 41
3.3.8. HPLC-FLD-MS/MS and UHPLC-Q-TOF-MS/MS for Identification and Quantification of Amino Acid and Phenolic Compounds in Rice Samples 42
3.3.8.1. HPLC-FLD-MS/MS Identification of Amino Acid 42
3.3.8.2. UHPLC Q-TOF-MS/MS Identification of Phenolic Compounds 42
3.3.9. Statistical Analysis 43
3.4. Results and Discussion 43
3.4.1. TPC, TFC, and TAC of Different Nine Rice Varieties 43
3.4.2. Antioxidant Analysis (DPPH, ABTS, & FRAP) 46
3.4.3. HPLC-FLD-MS/MS and UHPLC-Q-TOF-MS/MS Identification and Quantification of Amino Acid and Phenolic Compounds in Nine Different Brown Rice Samples 49
3.4.3.1. Amino Acid Detection in Nine Different Brown Rice Varieties 49
3.4.3.2. Phenolic Compounds Identification in Nine Different Rice Varieties 52
3.5. Conclusion 55
IV. Development of Antioxidative and Stress Reducing Fermented Brown Rice: Screening & Selection of Potential LAB through in vitro & Whole Genome Analysis 56
4.1. Abstract 57
4.2. Introduction 58
4.3. Materials and Methods 61
4.3.1. Rice Samples 61
4.3.2. Chemicals 61
4.3.3. Brown Rice Fermentation 61
4.3.4. Preparation of Extracts 61
4.3.5. Detection of Gamma Amino Butyric Acid (GABA) 62
4.3.6. Measurement of Total Phenolic Content (TPC) 62
4.3.7. Measurement of Total Flavonoid Content (TFC) 62
4.3.8. Assessing the Antioxidant Potential of BR Extract 63
4.3.8.1. DPPH Radical Scavenging Activity of BR 63
4.3.8.2. ABTS Radical Scavenging Activity of BR 63
4.3.8.3. Assessment of Antioxidant Activity using Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) Assay 64
4.3.9. Identification and Characterization of Bioactive Compounds in BR Extracts using UHPLC-Q-TOF-MS/MS 64
4.3.10. Network Pharmacology Analysis of Significant Metabolites from Fermented Brown rice 64
4.3.11. Assessing Cell Viability 65
4.3.12. Assessing Cellular Antioxidant Activity (CAA) 66
4.3.13. DNA Extraction & PCR 66
4.3.13.1. Primer used in the GAD Gene Detection 66
4.3.13.2. Protocols for PCR in GAD Gene Detection 67
4.3.14. Gamma Amino Butyric Acid (GABA) Detection in L. reuteri MRS Broth using HPLC Approach 67
4.3.14.1. Untargeted Metabolomics of the L. reuteri Bacteria to Detect Bioactive Compounds 67
4.3.15. Whole Genome Analysis of the L. reuteri 67
4.3.16. Data Analysis & Records 68
4.3.17. Statistical Analysis 68
4.4. Results and Discussion 69
4.4.1. Gamma Amino Butyric Acid (GABA) Analysis 69
4.4.2. TPC and TFC of Ethanol Extracts 71
4.4.3. Antioxidant Assays (DPPH, ABTS & FRAP) 73
4.4.4. Untargeted Metabolomics of Raw and Fermented Brown Rice Samples using UHPLC Q-TOF-MS/MS 74
4.4.4.1. Phenolic Compounds Detection 74
4.4.4.2. Amino Acid Profiling of Brown Rice 78
4.4.4.3. Fatty Acid Profiling of Brown Rice 82
4.4.5. Cell Viability Assay and Cellular Antioxidant Activity (CAA) 86
4.4.5.1. Cell Viability Assay 86
4.4.5.2. Assessing Cellular Antioxidant Activity (CAA) 88
4.4.6. Network Pharmacology Analysis 90
4.4.7. PCR Detection of L.reuteri for GAD Gene Confirmation 92
4.4.8. Gamma Amino Butyric Acid (GABA) Detection in L. reuteri Bacterial Broth 95
4.4.9. Untargeted Metabolomics of L. reuteri for Bioactive Compounds Identification 98
4.4.10. Whole Genome Analysis of L. reuteri 100
4.5. Conclusion 106
V. Fermented Brown rice Improves Stress-Related Disorders via Modulation of Gut Microbiota and Their Associated Metabolites 107
5.1 Abstract 108
5.2. Introduction 109
5.3. Materials and Methods 111
5.3.1. Psychobiotic Strain used in the Study 111
5.3.1.1. Brown Rice Sample 111
5.3.1.2. Synbiotics Preparation 111
5.3.2. Experimental Animals 111
5.3.2.1. Experimental Workflow 112
5.3.3. Chronic Mild Stress Induction Procedure 114
5.3.3.1. Body Weight and Food Intake Analysis 116
5.3.3.2. Behavioral Analysis 116
5.3.3.2.1. Elevated Plus Maze Test (EPMT) 116
5.3.3.2.2. Novel Object Recognition Test (NOR) 116
5.3.3.2.3. Forced Swim Test (FST) 116
5.3.3.2.4. Open Field Test (OFT) 117
5.3.4. Biochemical Measurements 117
5.3.5. Metagenomics Analysis using 16S rRNA Sequencing 117
5.3.6. Short-Chain Fatty Acid (SCFAs) Analysis 118
5.3.7. Untargeted Metabolomics of Mice Blood and Fecal samples 118
5.3.8. Expression Analysis of GABA Receptors (GABAAα2 & GABAB1β) in the Prefrontal Cortex 119
5.3.9. Statistical Analysis 119
5.4. Results and Discussion 119
5.4.1. Confirmation of Chronic Stress Induction 119
5.4.2. Psychobiotics FBR Significantly Improved Anxiety or Depression-related Behaviour and Cognitive Function 121
5.4.2.1. Body Weight and Food Intake Analysis 121
5.4.2.2. Elevated Plus Maze Test (EPMT). 121
5.4.2.3. Novel Object Recognition Test (NOR). 121
5.4.2.4. Open Field Test (OFT) 121
5.4.2.5. Forced Swim Test (FST). 121
5.4.2.6. Stress-Induced Corticosterone Levels. 122
5.4.2.7. Neurotransmitters Levels 122
5.4.2.8. Anti-Inflammatory Activities of FBR. 122
5.4.3. Effect of Psychobiotics FBR Administration on SCFAs 131
5.4.4. Psychobiotics FBR Administration Modulated the Altered Gut Microbiota Composition of Chronically Stressed Mice 133
5.4.5. Effect of Psychobiotics FBR Administration on Blood and Gut Metabolomics 141
5.4.6. Gene Expression Analysis using Prefrontal Cortex of Mice 150
5.5. Conclusion 152
VI. Conclusion 153
References 156
Abstract (Korean) 171
Acknowledgements 173

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