천연 다당류 고분자는 생체 적합성 및 생분해성, 낮은 세포 독성, 생리 활성 등의 특성으로 합성 고분자를 대체하여 다양한 산업에서 사용되고 있다. 다양한 천연 다당류 중 levan은 특정 미생물 및 식물 종에서 발견되는 fructan의 일종으로 단량체인 fructose가 대부분 β-(2,6) glycoside bond로 연결된 수용성의 fructan이다. Levan은 유사한 분자량을 가진 다른 다당류와 비교하여 용해도가 높고 점도가 매우 낮은 양친매성 고분자로, 다른 exopolysaccharide와 유사하게 화학적 변형 및 접착 특성을 가진다. 또한 levan은 열 안정성 및 높은 보습력과 산·염기성 매질에서 높은 안정성을 가져 식품 및 화장품, 의약품 등 다양한 응용 범위를 가진다.
Glycoside hydrolase 68 계열의 세포 외 효소인 levansucrase(EC 2.4.1.10)는 sucrose를 기질로 하여 비환원성 말단에 fructofranosyl group을 단계적으로 첨가하여 levan 사슬을 성장시키는 효소이다. Bacillus subtilis, Lactobacillus reuteri 및 Zymomonas mobilis와 같은 많은 박테리아 종에 따른 levansucrase의 특성이 연구되었다. 그러나 levansucrase를 생성하는 많은 미생물들은 가수분해 효소인 levanase를 동시에 생산하며, levansucrase 자체도 가수분해 및 전이 효소의 활성 모두에 Michaelis-Menten 동역학을 따르기 때문에 발효가 끝난 단계에서 즉각적인 효소의 억제가 필요하여 미생물 발효에 의한 levan의 생산이 어렵다.
효소는 화학 촉매와 비교하여 기질과 산물에 대한 특이성이 높다는 장점이 있지만, 온도와 pH 등 반응 조건의 변화에 민감하다. 또한 대부분의 효소는 물에 녹는 구형의 단백질로 회분식 공정에서 회수 및 재사용이 어렵다는 단점이 있다. 이를 해결하기 위한 방안으로 효소 고정화 기술이 활발히 이용되고 있으며, 다양한 유형의 지지체가 연구되었다. 일반적으로 효소 고정은 지지체를 물리·화학적으로 변형하기 쉽고 이에 따라 다양한 특성을 가지고 있으며, 효소의 열안정성 및 재사용성에 대한 이점을 가지고 있다. 그 중 Fe3O4 자성 나노입자는 외부 자기장을 이용한 빠른 효소의 분리 및 회수가 가능하며, 단위 질량당 높은 표면적을 가져 효소 고정화를 위한 이상적인 지지체이다. 또한 높은 생체적합성으로 인해 약물 전달 또는 온열치료 시스템과 같은 다양한 목적으로 활용된다.
본 연구에서는 levan의 효율적인 합성을 위해 재조합 levansucrase를 Fe3O4 자성 나노입자에 고정화하고자 하였으며, Figure 1에 간략한 모식도를 나타내었다. 유전자 재조합 기술을 통하여 세포 외 발현이 가능한 B. subtilis 유래의 levansucrase의 발현 vector를 구축하며, C-terminal에 6X His tag를 추가하여 용이한 정제를 유도하였다. 재조합 levansucrase는 GA (glutaraldehyde)를 가교제로 하여 표면을 APTES (3-aminopropyltriethoxysilane)로 개질한 Fe3O4 자성 나노입자에 고정하였으며, (i) GA의 농도, (ii) 가교 시간, (iii) 지지체와 효소의 농도에 따른 고정화 반응 조건을 최적화하였다. Levansucrase 고정 전후의 Fe3O4 자성 나노입자의 구조 및 물리 화학적 특성을 FT-IR (Fourier transform infrared spectroscopy), SEM (scanning electron microscopy), TEM (transmission electron microscopy), XRD (X-ray diffraction), VSM (vibrating sample magnetometry)을 통해 조사하였다. 고정화 전후 levansucrase의 활성도와 안정성을 다양한 작동 조건에서 비교 분석하였으며, 고정된 levansucrase의 재사용성 및 저장 안정성을 조사하여 levan 생산에 적용 가능성을 확인하고자 하였다.

Levan, a natural fructan linked by β-2,6 glycosidic bonds, is widely used in the pharmaceutical and biotechnology industries. In this paper, recombinant levansucrase was immobilized on Fe3O4 magnetic nanoparticles for the efficient synthesis of levan. Through gene recombination technology, an expression vector of levansucrase derived from B. subtilis was constructed to include signal peptide and enable extracellular expression. A 6X His-tag was added to the C-terminus of the levansucrase gene (sacB) to facilitate purification after protein expression. Fe3O4 magnetic nanoparticles were synthesized by coprecipitation, and the surface was modified with amino groups from 3-aminopropyltriethoxysilane. Recombinant levansucrase was immobilized on Fe3O4 magnetic nanoparticles with glutaraldehyde (GA) as a cross-linking agent. The immobilization reaction conditions were optimized according to (i) GA concentration, (ii) crosslinking time, and (iii) support and enzyme concentration. Optimal enzyme immobilization was attained with 20 mM of glutaraldehyde (crosslinking), 3 h of crosslinking, and at a 2:1 ratio of magnetic nanoparticles to protein (w/w); the recovery activity of the immobilized enzyme reached 86.9±2.8 %, 90.2±2.3 %, and 84.8±1.6 %, respectively. The synthesized Fe3O4 magnetic nanoparticles were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), scanning electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy (TEM), vibrating sample magnetometry (VSM), and X-ray diffraction (XRD). The particles are about 20 nm, have a smooth spherical surface, and behave like superparamagnetic materials. The operating conditions of levansucrase before and after immobilization were measured at various temperatures and pH ranges, and pH stability and thermal stability were analyzed. It was confirmed that the pH stability and thermal stability of the immobilized levansucrase increased over the entire range. The reusability and storage stability of the immobilized levansucrase were investigated, and the immobilized levansucrase retained 60.6±3.5 % of its initial activity even after 5 recycling cycles. This procedure provides a more straightforward way to prepare Levan.