Antigen Discovery and Monoclonal Antibody Production for Diagnosis of Bursaphelenchus xylophilus [Steiner and Buhrer] and Infected Pine Trees :소나무 재선충과 소나무 재선충 감염 소나무의 진단을 위한 항원 발굴 및 단일 클론 항체 제작

김아영

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자료유형: 학위논문

저자정보: 김아영 (서울대학교, 서울대학교 대학원)

지도교수: 이시혁

발행연도: 2021

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이용수2

이 논문의 연구 히스토리 (2)

2021

Antigen Discovery and Monoclonal Antibody Production for Diagnosis of Bursaphelenchus xylophilus [Steiner and Buhrer] and Infected Pine Trees

김아영 농생명공학부 2021.01 학위논문

2018

소나무재선충[Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle]의 GaLectin에 대한 특이적인 단클론 항체 제작과 진단에의 활용

김아영 , 김영하 , 최보혜 외 5명 한국응용곤충학회지 2018.01 학술저널

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소나무는 한국인의 삶과 정서에 매우 밀접한 관련이 있는 나무이다. 소나무 재선충 (Bursapelencus xylopilus)은 소나무의 재선충 병을 일으키는 선충으로, 현재 전 세계의 소나무를 위협하는 가장 심각한 해충이다. 소나무재선충병이 확산됨에 따라 산림은 점차 황폐해지고 있고, 매년 소나무 재선충 방제를 위한 대규모 국가 예산이 투입되고 있다. 감염된 소나무를 효과적으로 치료할 방법이 없기 때문에 현재 가장 확실한 방제 방법은 소나무 재선충과 벡터 곤충에 감염된 소나무의 이동을 차단하고, 감염된 나무를 훈증 처리하는 것이다. 따라서, 소나무가 재선충에 감염되었는지 여부를 신속하게 확인하는 방법의 개발은 소나무 재선충병 확산 방지 및 방제에 매우 중요하다. 그러나, 기존에 개발된 재선충 감염 진단 방법들은 소나무 재선충 유전자를 이용한 분자진단법으로 대부분 정교한 장비가 필요하고, 긴 시료 추출 시간과 반응 시간을 필요로 한다. 또한, 시료 추출 및 처리에 전문적인 기술이 필요하다는 단점이 있다. 그러므로, 소나무재선충 확산 방지 및 방제를 위해서는, 현장에서 빠르고 쉽게 진단이 가능한 항원-항체반응을 이용한 신속진단 키트 개발이 필요하다.
하지만, 현재까지 소나무 재선충 또는 소나무 재선충 감염목의 특이 항원은 거의 보고된 바가 없다. 따라서 먼저, 소나무 재선충 특이 항원을 밝혀내기 위해서 단백질체학과 발현유전체학 연구를 수행하여 소나무재선충 특이 발현 유전자 126개와 특이 단백질체 90개를 발굴하였다. Bioinformatics 분석을 수행하여 소나무 재선충이 소나무 침입시에 분비를 할 것으로 예상되는 22개의 항원도 확인 하였다. 그 22개의 항원에 대하여 단클론 항체 제작을 시도 하여 4가지 항원(Expansin B3, Galectin, PWN-aldose reductase 1, PWN-secretory antigen 571)에 대한 단클론 항체들을 제작하고, 항체의 특성을 조사하는 연구를 진행을 하였다. 그 결과, 발굴한 항원과 단클론 항체들이 소나무 재선충 이나 소나무 재선충 감염목의 진단에 활용될 수 있음을 보여주었다. 이들을 이용한 진단키트 제작 연구는 항원-항체 진단키트의 제작을 가능하게 할 수 있을 것이다. 또한 이 항체들을 이용한 기초 연구는 소나무 재선충이 소나무를 침범하는 메커니즘을 밝혀내는데도 도움이 될 것이다.

The pine tree is intimately associated with the life and emotions of Koreans. Currently, the pine wood nematode (PWN) Bursaphelenchus xylophilus-the causative pathogen of pine wilt disease (PWD)-is the most serious pest threatening pine trees worldwide. In Korea, the spread of PWD is destroying forests, and exhausting large national budgets spent every year to control the disease.
To date, there is no effective treatment for pines infected with PWN. The most reliable control method is to block the transportation of trees infected with PWN or the vector insects, and the infected pine trees are then fumigated.
In this context, the development of an accurate method to quickly determine whether a pine tree is infected with PWN is needed to prevent and control PWD spread. Diagnosis based on molecular methods that use the PWN gene has disadvantages in that it requires sophisticated equipment and time-consuming sample extraction and reaction times. Furthermore, a specialized technique is required to extract genetic material from pine tree samples. An alternative approach is to develop a rapid diagnostic kit based on antigen-antibody interactions for quick and simple diagnosis in-field. This concept forms the basis of the current study.
With only a few specific antigens of PWN reported previously, I first performed transcriptome and proteomic analyses to identify specific antigens for PWN. I found 126 PWN-specific genes and 90 PWN-specific proteins. Among them, 22 antigens were expected to be secreted by PWN when invading the pine tree.
Attempts to generate monoclonal antibodies to these 22 antigens resulted in four monoclonal antibodies against four antigens (expansin B3, galectin, PWN-aldose reductase 1, PWN-secretory antigen 571). From an investigation into their characteristics, it was confirmed that the discovered antigens and the produced monoclonal antibodies could be used for the diagnosis of PWN or PWN-infected pines.
Further studies using these antigens and antibodies generated might lead to the imminent development of antigen-antibody-based diagnostic kits. In addition, studies using these antibodies will help to understand the molecular and cellular mechanism of pine tree invasion by PWN.

#Bursaphelenchus xylophilus #Pine trees #diagnosis #monoclonal antibodies #Expansin B3 #Galectin #PWN-aldose reductase 1 #PWN-secretory antigen 571 #소나무 재선충 #소나무 #진단 #단클론 항체

GENERAL INTRODUCTION 1
CHAPTER I Discovering specific genes and specific proteins of Bursaphelenchus xylophilus 6
Introduction 8
I-1. Discovering Bursaphelenchus xylophilus-specific genes using proteo-genomics 11
Abstract 11
1. Materials and Methods 12
1.1. Nematode rearing 12
1.2. Nematode collection 12
1.3. Total RNA extraction 13
1.4. TruSeq library quality control(QC) and illumina sequencing 13
1.5. Data analysis 14
2. Results and Discussion 15
2.1. Quality control result of four laboratory-cultured nematode samples 15
2.2. TruSeq library of four laboratory-cultured nematode samples 18
2.3. Miseq sequencing 21
2.4. HiSeq sequencing 24
2.5. Databases for B. mucronatus, B. thailandae and B. doui 27
2.6. Genes specifically expressed in B. xylophilus 32
I-2. Discovery of Bursaphelenchus xylophilus-specific expression proteins using label-free proteomics 86
Abstract 86
1. Materials and Methods 87
1.1. Nematode sample 87
1.2. PWN Infected pine tree (PWNIPT) sample 87
1.3. Liquid chromatography-mass spectrometry 88
2. Results 89
2.1. Proteins specifically expressed in PWN 89
3. Discussion 115
CHAPTER II Construction of monoclonal antibodies against Bursaphelenchus xylophilus-specific antigens 119
Introduction 121
II-1. Expansin B3 as a marker for detecting pine wood nematode-infected pine trees 123
Abstract 124
1. Introduction 125
2. Materials and Methods 128
2.1. Syntehsis of peptide antigens 128
2.2. Immunization of mice 128
2.3. Generation of a Mab cell line 131
2.4. Enzyme Linked Immunosorbent assay (ELISA) 131
2.5. Primary screening of EXPB3 132
2.6. Secondary screening with the pooled PBS extracts of 74 PWNIPT 136
2.7. Single-cell cloning by limited dilution 136
2.8. Statistical analysis 136
3. Results 138
3.1. Primary screening using the antigenic peptide 138
3.2. Suitable solution for antigen extraction for EXPB3-Mabs 140
3.3. Hybridoma lines with specific reactivity to PWNIPT 142
3.4. EXPB3-Mab-3-3-D9 and -3-3-H3 with high normalization specificity for PWNIPT 144
3.5. Immunoreactivity variation in PWNIPT 149
4. Discussion 152
II-2. Development of monoclonal antibodies specific to galectin of pine wood nematode and their utilization for detection of pine wood nematodes 155
Abstract 155
1. Introduction 157
2. Materials and Methods 159
2.1. PWN GaLectin cDNA cloning 159
2.2. Expression and purification using baculovirus expression 159
2.3. Immunization of mice 160
2.4. Generation of Mab cell line 160
2.5. PWNIPT extracts and healthy pine tree extracts 161
2.6. Nematode protein extraction 161
2.7. Cell limited dilution 161
2.8. ELISA 162
3. Results 163
3.1. GaLectin expression and purification for Mab production 163
3.2. Reactivity to standard PWNIPTs PBS extracts and PWN PBS extracts from 62 hybridoma cell lines 165
3.3. Establishment of Mab-secreting cell lines 167
4. Discussion 170
II-3. Identification of aldose reductase 1 as a pine wood nematode secretory enzyme and generation and characterization of its monoclonal antibodies 172
Abstract 172
1. Introduction 174
2. Materials and Methods 176
2.1. Cloning PWN-AR1 176
2.2. Expression and purification of PWN-AR1 using baculovirus expression system 177
2.3. Generation of immunized mice and Mab-secreting cell lines 177
2.4. PWNIPT and HPT extraction 177
2.5. Nematode culture and protein extraction 178
2.6. ELISA 178
3. Results 180
3.1. Highly expressed aldose reductase 180
3.2. Baculovirus expression system expression of PWN-AR1 185
3.3. Generation and characterization of PWN-AR1 Mabs 187
3.4. PWN-AR1 Mab with strong immunoreactivity to PWN extract 189
3.5. High immunoreactivity against infected pine extracts of PWN-AR1 Mab 11-E10-G2 191
3.6. Different sensitivities to four different nematode extracts 193
4. Discussion 195
II-4. Pine wood nematode secretory antigen 571 as a biomarker for the pine wood nematode and its monoclonal antibodies for detecting PWN and its infected pine tree 198
Abstract 198
1. Introduction 200
2. Materials and Methods 201
2.1. Characteristics of PWN-secreting antigen 201
2.2. Design of two peptide antigens of PWN-SA571 202
2.3. Mab generation 202
2.4. ELISA screening 203
2.5. Antigen extraction from four kinds of nematodes 204
2.6. Standard extracts for HPT or PWNIPT 204
2.7. Biotinylation of purified IgG or IgM from ascites 204
2.8. Isotyping of Mabs 204
2.9. LFA 205
2.10. Comparison of PWN antigen extraction efficiency 205
2.11. Dot blot 206
3. Results 207
3.1. Two peptide designs for PWN-SA571 207
3.2. Mab generation to PWN-SA571 peptides 212
3.3. Mab isotypes 215
3.4. Immunoreactivity of the established Mab cell line ascite 217
3.5. LFA application possibility using PWN-SA571-specific Mab supernatant 220
3.6. Reactivity of Purified and Biotinylated IgG of IgM PWN-SA571 Mabs to PWN Extract 223
4. Discussion 224
GENERAL CONCLUSION 227
LITERATURES CITED 232
KOREAN ABSTRACT 241

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