활성산소종(ROS)은 세포의 생존, 노화, 분화 등 많은 부분에서 여러 가지 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 적정 수준의 ROS는 세포에 긍정적인 효과를 나타내지만, 과도하게 축적된 ROS는 산화 스트레스를 유발하여 세포에 부정정인 영향을 미치게 되고, 이러한 영향을 막기 위해 항산화 조절인자들이 작용을 한다. 최근 적정 수준의 ROS는 세포의 생존 및 분화에 필요하다는 보고가 있다. 본 발표는 세포 내 ROS 수준을 조절하는 외인성 및 내인성 항산화 인자들이 어떠한 방식으로 조골세포 분화를 조절하는지에 대하여 그 효과와 분자적 기전에 대한 내용이다.

뼈는 조골세포와 파골세포의 역할이 균형을 이루어 일정 수준으로 유지되고 있으며, 이 때 뼈의 형성을 담당하고 있는 세포는 조골세포이다. 조골세포는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSCs)로부터 유래하여 분화가 되고, MSCs는 조골세포뿐만 아니라 지방세포(Adipocyte), 연골세포(Chondrocyte), 근원세포(Myoblast) 등의 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 다분화능을 가진 줄기세포이다.

Peroxiredoxins(Prxs)는 대표적인 항산화효소로 H2O2를 소거하여 다양한 신호전달경로를 조절하는 기능을 갖고 있어 다양한 연구가 이루어져 왔다. 조골세포 분화에서 Prx II가 조골세포 분화에 있어서 어떤 역할을 하는지에 대해 알아보기 위해서 중간엽 줄기세포인 C3H10T1/2 세포가 BMP2에 의해 조골세포로 분화시키는 과정에서 Prx II의 역할을 확인하기 위해, Prx II 유전자를 과발현 또는 knockout을 유도하여 그 영향을 분석하였다. 그 결과, Prx II의 과발현은 BMP2에 의해 증가하는 초기 조골세포 분화 표지 유전자인 Id1, Dlx5, Runx2의 발현을 억제한다는 것을 RT-PCR과 Real-time PCR을 이용하여 확인하였다. BMP2 신호전달 경로에서 Id1 및 Dlx5보다 상위 단계에 있는 Smad1/5/9 인산화에도 영향을 미치는지 확인하였고, Prx II는 BMP2가 증가시키는 Smad1/5/9의 인산화를 감소시켰다. 앞선 결과들을 토대로 Prx II가 조골세포 분화를 감소시키는 분자적 기전을 더 자세하게 알아보기 위해 CRISPR/Cas9 system을 이용하여 knockout(KO) 세포주를 제작하여 BMP2를 처리하였고, 그 결과 wild type(WT) 세포에 비해 Prx II KO 세포에서 BMP2에 의한 조골세포 분화 표지 유전자들의 발현과 ALP 효소 활성이 더 강화되는 것을 확인하였다. 이어서, Prx II를 과발현시켜 조골세포 분화를 억제하는 인자들을 확인해본 결과 PP2A Cα의 발현을 증가시켰다. WT 세포와 Prx II KO 세포를 비교하여 WT 세포에서는 PP2A Cα의 발현이 증가했지만 Prx II KO 세포에서는 증가하지 않는 것도 재확인하였다. 쥐를 이용한 동물 수준에서도, WT mouse에 비해 Prx II KO mouse에서 뼈 관련 표현형인 골밀도(BMD), (뼈 부피/조직 부피(BV/TV), 해면골 면적(Tb.Sp), 그리고 해면골 수(Tb.N))가 WT에 비해 Prx II knockout 쥐에서 유의적인 증가를 보였다. 결과를 종합해 보면, 항산화 조절 효소중 하나인 Prx II는 세포 수준에서 PP2A Cα의 발현을 증가시켜 조골세포 분화를 감소시키고, 동물 모델에서 골 형성을 감소시킨다는 것을 입증하였다.

단풍취(Ainsliaea acerifolia)에서 유래한 zaluzanin C(ZC)는 sesquiterpene lactone계열의 천연물로 항진균, 항염증, 항암 효과가 알려져 있다. Zaluzanin C에 의한 조골세포 분화 효과에 대한 연구 결과는 보고된 바가 없었고, 본 연구에서는 항산화 물질인 zaluzanin C가 조골세포 분화에 미치는 영향에 대하여 알아보았다. C3H10T1/2 세포와 MC3T3-E1 세포에 zaluzanin C를 처리하여 조골세포 분화 표지 유전자의 발현을 확인하였다. Zaluzanin C는 C3H10T1/2 세포와 MC3T3-E1 세포 모두에서 Id1, Dlx5, Runx2와 같은 초기 조골세포 분화 표지 유전자의 발현을 증가시켰을 뿐만 아니라 ALP 효소 활성과 세포외기질의 무기질화도 증가시켰다. 이는 zaluzanin C가 조골세포 분화에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

CRTC2는 당 신생합성에서 CREB의 coactivator로 작용하여 표적 유전자의 전사활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 그리고 최근에는 자가면역 질환에도 영향을 미치는 것으로도 보고가 되어 있다. 하지만 조골세포 분화에서 CRTC2의 역할에 대해서는 알려진 바가 없었고, 본 연구는 CRTC2가 조골세포 분화에 미치는 영향과 그 분자적 기전을 밝히는 것에 있다. MC3T3-E1에서 CRTC2의 발현은 TNF-α 처리에 의해 mRNA 발현과 단백질 수준이 증가했고, CRTC2의 과발현은 조골세포 표지 유전자의 발현, ALP 효소 활성, 세포외기질의 무기질화 모두 감소시키는 결과를 나타냈다. CRTC2의 knockdown은 TNF-α에 의해 감소하는 조골세포 분화를 회복시켰다. 또한 CRTC2의 발현은 Smad1의 분해를 촉진시키는 인자로 알려진 Smurf1의 발현을 증카시켰다. 이러한 결과들은 CRTC2는 BMP2가 증가시키는 조골세포 분화를 Smurf1의 발현을 유도하여 억제한다는 것이다.

ChREBP는 간에서 포도당의 농도 수준에 따라 조절되는 지방생성에 관여하는 주요 전사인자이다. 하지만 조골세포 분화에서 ChREBP의 역할에 대한 보고는 미비한 상황이다. 본 연구는 MC3T3-E1 세포에서 ChREBP가 미치는 영향과 그 분자적 기전을 규명하는 것이다. ChREBP의 발현은 에탄올에 의해 증가하였고, 이 때 조골세포 분화는 억제되었다. 반대로 조골세포 분화를 유도하는 BMP2는 ChREBP의 발현을 증가시키지 않았다. ChREBP의 기능을 확인하기 위하여, ChREBP를 과발현 하였고, 그 결과, BMP2에 의해 유도되는 조골세포 분화를 감소시켰다(mRNA 발현, 단백질 수준, ALP 활성). 기존 연구 결과에 따라 ChREBP의 상위 조절 인자로 PP2A를 확인해 보았고, PP2A의 활성부위인 PP2A Cα의 과발현은 ChREBP의 발현을 증가시켰다. 반대로 PP2A의 저해제인 okadaic acid(OA)처리에 의해 ChREBP의 발현이 억제되었고, 에탄올이 감소시키는 조골세포 분화를 다시 회복시켰다. 지금까지의 결과를 종합하면, 에탄올은 PP2A에 의존적으로 ChREBP의 발현을 증가시켜 조골세포의 분화를 억제한다는 것을 증명하였다.

본 연구 결과는 과도한 항산화 기능은 조골세포 분화에 부정적인 영향을 미치고 적정 수준의 항산화 작용은 조골세포 분화를 증가시키며 당 대사 관련 인자들이 조골세포의 분화를 감소시킨다는 것이다.

Reactive oxygen species (ROS) are known to have various effects in many fields such as cell survival, aging, and differentiation. An appropriate level of ROS exerts a positive effect on cells, but excessively accumulated ROS induces oxidative stress to negatively affect cells, and antioxidant regulators act to prevent this effect. Recently, it has been reported that an appropriate level of ROS is necessary for the survival and differentiation of cells. This presentation describes the effects and molecular mechanisms of how exogenous and endogenous antioxidant factors that regulate intracellular ROS levels regulate osteoblast differentiation. In the bone, the role of osteoblasts and osteoclasts is balanced to maintain the quality of the bones, and at this time, osteoblasts play a role in forming bones. Osteoblasts are differentiated from mesenchymal stem cells (MSCs), and MSCs are not only osteoblasts, but also various cells such as adipocytes, myoblasts, and chondrocytes. It is a stem cell with pluripotency that can differentiate. Peroxiredoxins (Prxs) is a representative antioxidant enzyme, and has a function of regulating various signaling pathways by scavenging H2O2, so many studies have been conducted. In order to investigate the role of Prx II in osteoblast differentiation in osteoblast differentiation, to confirm the role of Prx II in the process of differentiating mesenchymal stem cells, C3H10T1/2 cells into osteoblasts by BMP2, The effect of Prx II gene was analyzed by inducing overexpression or knockout. It was confirmed by RT-PCR and Real-time PCR that overexpression of Prx II inhibits the expression of Id1, Dlx5, and Runx2, which are early osteoblast differentiation marker genes that are increased by BMP2. In the BMP2 signaling pathway, it was confirmed that the phosphorylation of Smad1/5/9, upstream of Id1, was also affected, and Prx II reduced the phosphorylation of Smad1/5/9 increased by BMP2. Based on the previous results, in order to verify the molecular mechanism by Prx II in more detail, a knockout (KO) cell line was produced using the CRISPR/Cas9 system and treated with BMP2. As a result, Prx II KO compared to wild type (WT) cells. It was confirmed that the expression of osteoblast differentiation marker genes and ALP enzyme activity by BMP2 in cells were further enhanced. In addition, in order to find out through which mechanism inhibits osteoblast differentiation induced by BMP2, Prx II overexpressed to confirm the factors that inhibit osteoblast differentiation, the expression of PP2A Cα was increased. By comparing WT cells and Prx II KO cells, it was also confirmed that the expression of PP2A Cα increased in WT cells, but not in Prx II KO cells. Even at the animal level using rats, bone-related phenotypes (volume/tissue volume (BV/TV), cancellous bone area (Tb.Sp), bone density (BMD) and cancellous bone count (Tb.N)) in Prx II KO mice compared to WT mice.) Showed a significant increase in Prx II knockout mice compared to WT. Through the above results, it was proved that Prx II, one of the antioxidant regulating enzymes, inhibits osteoblast differentiation by increasing the expression of PP2A Cα at the cellular level and reduces bone formation at the animal level. Zaluzanin C(ZC), which is derived from Ainsliaea acerifolia, is a sesquiterpene lactone family of natural products and has antifungal, anti-inflammatory and anticancer effects. There have been no reports of research results on the effect of zaluzanin C on osteoblast differentiation. In this study, the effect of the antioxidant zaluzanin C on osteoblast differentiation was investigated. C3H10T1/2 cells and MC3T3-E1 cells were treated with zaluzanin C to confirm the expression of osteoblast differentiation marker genes. Zaluzanin C not only increased the expression of early osteoblast differentiation marker genes such as Id1, Dlx5, and Runx2 in both C3H10T1/2 cells and MC3T3-E1 cells, but also increased ALP enzyme activity and mineralization of extracellular matrix. This indicates that zaluzanin C has a positive effect on osteoblast differentiation. CRTC2 is known to regulate the transcriptional activity of target genes by acting as a coactivator of CREB in gluconeogeneesis. And recently, it has also been reported to affect autoimmune diseases. However, the role of CRTC2 in osteoblast differentiation was not known, and this study aims to clarify the effect of CRTC2 on osteoblast differentiation and its molecular mechanism. In MC3T3-E1, the expression of CRTC2 increased mRNA expression and protein levels by TNF-α treatment, and overexpression of CRTC2 decreased the expression of osteoblast marker genes, ALP enzyme activity, and mineralization of extracellular matrix. CRTC2 knockdown restored osteoblast differentiation, which was reduced by TNF-α. In addition, the expression of CRTC2 increased the expression of Smurf1, which is known as a factor that promotes the degradation of Smad1. These results indicate that CRTC2 inhibits osteoblast differentiation, which is caused by BMP2, by inducing the expression of Smurf1. ChREBP is a major transcription factor involved in adipogenesis, regulated by the level of glucose concentration in the liver. However, reports on the role of ChREBP in osteoblast differentiation are insufficient. ChREBP is a major transcription factor involved in adipogenesis, regulated by the level of glucose concentration in the liver. However, reports on the role of ChREBP in osteoblast differentiation are insufficient. This study is to investigate the effect of ChREBP and its molecular mechanism in MC3T3-E1 cells. The expression of ChREBP was increased by ethanol, and osteoblast differentiation was inhibited at this time. Conversely, BMP2, which induces osteoblast differentiation, did not increase the expression of ChREBP. To confirm the function of ChREBP, ChREBP was overexpressed, and as a result, osteoblast differentiation induced by BMP2 was reduced (mRNA expression, protein level, ALP activity). According to the results of previous studies, PP2A was identified as an upper regulator of ChREBP, and overexpression of PP2A Cα, the active site of PP2A, increased the expression of ChREBP. On the contrary, the expression of ChREBP was suppressed by the treatment with okadaic acid (OA), an inhibitor of PP2A, and the osteoblast differentiation caused by ethanol was restored again. Summarizing the results so far, it was proved that ethanol inhibits osteoblast differentiation by increasing the expression of ChREBP dependent on PP2A. The expression of ChREBP was increased by ethanol, and osteoblast differentiation was inhibited at this time. Conversely, BMP2, which induces osteoblast differentiation, did not increase the expression of ChREBP. To confirm the function of ChREBP, ChREBP was overexpressed, and as a result, osteoblast differentiation induced by BMP2 was reduced (mRNA expression, protein level, ALP activity). According to the results of previous studies, PP2A was identified as an upper regulator of ChREBP, and overexpression of PP2A Cα, the active site of PP2A, increased the expression of ChREBP. On the contrary, the expression of ChREBP was suppressed by the treatment with okadaic acid (OA), an inhibitor of PP2A, and the osteoblast differentiation caused by ethanol was restored again. Summarizing the results so far, it was proved that ethanol inhibits osteoblast differentiation by increasing the expression of ChREBP dependent on PP2A.

The results of this study are that excessive antioxidant function negatively affects osteoblast differentiation, an adequate level of antioxidant activity increases osteoblast differentiation, and glucose metabolism related factors reduce osteoblast differentiation.