활성산소(Reactive Oxygen Species; ROS)는 세포 내에서 대사과정 중 자연스럽게 발생하는 반응성이 큰 산소분자로써 생물학적 기능 연구는 물론 염증, 암, 퇴행성신경질환 등의 질환의 발생에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 인간 같은 포유동물에는 이러한 활성산소를 제거하여 세포의 항상성을 유지하기 위해 다양한 항산화효소를 생성하는 체계가 잘 갖추어져 있다. Peroxiredoxins(Prxs)는 항산화효소 중 가장 최근에 알려진 항산화효소이며 H2O2를 제거하여 신호전달경로를 조절하는 기능을 갖고 있어 많은 연구가 이루어져 왔다. 뼈는 끊임없이 흡수되고 생성되는 활동성이 큰 조직이다. 뼈의 흡수는 파골세포(Osteoclast)에 의해 이루어지고 뼈의 형성은 조골세포(Osteoblast)에 의해 진행된다. 건강한 사람의 경우 이러한 두 가지 세포 사이의 조절이 적절하게 유지되어 건강한 상태로 유지되지만 반대로 균형이 무너지게 될 경우 골다공증, 골감소증과 같은 다양한 골 관련 질환이 발생하게 된다. 이 중 조골세포는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSCs)로부터 유래되었으며, 이 MSCs는 조골세포 뿐만 아니라 지방세포(Adipocyte), 근원세포(Myoblast), 연골세포(Chondrocyte) 등으로 분화할 수 있는 다분화능 줄기세포이다. 현재까지 항산화 효소인 Prx II(Peroxiredoxin II)의 조골세포 분화에 미치는 영향에 대한 연구는 전무한 실정이다. 본 연구는 조골세포 분화에서 Prx II가 조골세포 분화에 있어서 어떠한 역할을 하는지에 대해 알아보기 위해 쥐 수정란 유래의 중간엽 줄기세포인 C3H10T1/2 세포를 조골세포로 분화시키는 과정에서 Prx II의 발현을 확인하였고, Prx II 유전자 과발현에 의한 영향을 분석하였다. 그 결과, C3H10T1/2 세포에서 조골세포 분화 과정에서 Prx II의 유전자 발현은 증가하는 듯 보였으나 다시 감소하였고, BMP2에 의한 조골세포 분화 마커 유전자인 Dlx5의 발현을 억제한다는 것을 RT-PCR과 Real-time PCR을 이용하여 확인하였다. 이 결과들을 바탕으로 Prx II가 Dlx5의 발현을 감소시키는 것 이외에 이를 조절하는 Smad1/5/9의 인산화에도 영향을 주는지 Western blot을 이용하여 확인해보았다. 그 결과, Prx II는 BMP2에 의해 증가한 Smad1/5/9의 인산화를 감소시켰다. 앞선 결과들을 토대로 Prx II에 의한 분자적 기전을 더 자세하게 알아보기 위해 CRISPR/Cas9 system을 이용하여 knockout 세포주를 제작하였다. Prx II가 knockout 되어있는 것을 Western blot으로 확인하였으며, wild type 세포와 Prx II knockout 세포에 각각 BMP2를 처리하여 조골세포 분화 마커 유전자들의 발현량을 확인하였다. 그 결과 wild type 세포에 비해 Prx II knockout 세포에서 BMP2에 의한 조골세포 분화 마커 유전자들의 발현이 더 증가되는 것을 확인하였고, 뿐만 아니라 Alkaline phosphatase (ALP) 효소 활성도 더 증가하는 것을 확인하였다. 이어서, 어떠한 기전을 통해 BMP2에 의해 유도되는 조골세포 분화를 억제하는지 알아보기 위해 Prx II를 과발현시켜 조골세포 분화를 억제하는 인자들을 확인해본 결과 Smurf2의 발현을 증가시켰다. Wild type 세포와 Prx II knockout 세포를 비교하여 wild type에서는 Smurf2가 증가했지만 Prx II 세포에서는 증가하지 않는 것도 재확인하였다. 위의 세포수준의 결과를 토대로 Prx II knockout 쥐를 이용하여 동물 수준에서도 같은 결과를 얻을 수 있는지 확인하였다. Wild type mouse와 Prx II knockout mouse를 Micro-CT 촬영을 해본 결과 뼈와 관련된 표현형인 뼈의 부피/조직 부피(BV/TV), 해면골 면적(Tb.Sp), 골밀도(BMD) 그리고 해면골 수(Tb.N) 모두에서 wild type에 비해 Prx II knockout 쥐에서 유의차 있는 증가를 보였다. 이상의 결과를 통해, 항산화 조절 효소중 하나인 Prx II는 세포 수준에서 Smurf2의 발현을 증가시켜 조골세포 분화를 억제시키고, 동물 수준에서 골 형성을 감소시킨다는 것을 증명하였다.

Peroxiredoxins (Prxs) are a family of antioxidant proteins that reduce peroxide levels by using reducing agents such as thioredoxin. These proteins were characterized to have a number of cellular functions, including cell proliferation and differentiation and protection of specific proteins from oxidative damage. Peroxiredoxin 2 is a member of the mammalian peroxiredoxin family of thiol proteins that is important in antioxidant defense and redox signaling.
Bone homeostasis is maintained by a balance between bone resorption by osteoclasts and bone formation by osteoblasts. Excessive activation of osteoclast induces bone diseases such as osteoporosis. Osteoblasts derived from a mesenchymal stem cells (MSCs), and their differentiation is controlled by many growth factors, cytokines and environmental factors. Bone morphogenetic proteins (BMPs) are multifunctional cytokines that play important roles in various cellular functions. In osteoblasts, BMP2 stimulates osteoblast differentiation by activating smad1/5/8, which regulates expression of osteogenic markers such as distal-less homeobox 5 (Dlx5), Runt-related transcription factor 2 (Runx2), osteocalcin (OC) and bone sialoprotein (BSP). Osteoblasts are key components of the bone multicellular unit and have a seminal role in bone remodeling, which is an essential function for the maintenance of the structural integrity and metabolic capacity of the skeleton. However, the correlation of Antioxidant enzyme peroxiredoxin II between osteoblasts remains unclear. To investigate whether Prx II is associated with osteoblast differentiation, this study examined mRNA expression of Prx II in C3H10T1/2 cells. In osteogenic condition, Prx II was increased until 2 days and then decreased. To investigate the effect of Prx II, C3H10T1/2 cells were transiently transfected with pCMV-Prx II. Overexpression of Prx II decreased expression of BMP2-induced osteogenic gene Dlx5, expressed at the early stage of osteogenesis. Moreover, Prx II inhibit BMP2-induced Smad1/5/9 phosphorylation and ALP activity. Prx II increased the expression of Smurf1 and Smurf2. Smurf2 expression was increased in wild type cells however Smurf2 was not increased in Prx II knouckout cells. Micro-CT experiments in vivo study showed that bone-related phenotypes were significantly increased in Prx II mice compared to wild type mice. Taken together, these results demonstrate that Prx2 not only inhibits osteoblast differentiation via Smurf2 expression, but also inhibits bone formation in vivo.