Microsatellite를 이용한 한국 산양(Naemorhedus caudatus)의 유전적 다양성 분석과 DEAD-box RNA helicase 3 유전자를 이용한 성판별 :Genetic diversity analysis using microsatellite and sex identification using DEAD-box RNA helicase 3 gene in the Korean goral (Naemorhedus caudatus)

이효정

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자료유형: 학위논문

저자정보: 이효정 (강원대학교, 강원대학교 대학원)

지도교수: 이성진

발행연도: 2020

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이 논문의 연구 히스토리 (2)

2020

Microsatellite를 이용한 한국 산양(Naemorhedus caudatus)의 유전적 다양성 분석과 DEAD-box RNA helicase 3 유전자를 이용한 성판별

이효정 동물생명과학과 2020.01 학위논문

한국 산양(Naemorhedus caudatus)에서 DDX3 유전자를 이용한 성 판별

이효정 , 안상진 , 최소영 외 5명 동물자원연구 2020.01 학술저널

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산양(Naemorhadus caudatus)은 국제적으로 멸종위기종 취약에 속해 있을 뿐만 아니라 국내에서도 멸종위기종으로 지정되어 있다. 1960년대에 폭설로 인한 사냥으로 인해 급격하게 감소된 개체 수는 현재 약 800마리까지 회복되었으나, 현재까지 일부 지역에서만 관찰되었다. 제한된 서식지는 유전적 다양성을 감소시키며 이로 인해 근친교배가 증가하면서 멸종 가속화의 요인이 될 수 있다. 또한 성비의 불균형이 멸종의 한 요인으로 작용할 수 있기 때문에 산양의 지역 내 유전적 다양성과 성비의 지속적인 관찰은 매우 중요하다. 하지만 산양에서 유전적 다양성과 성 판별에 대한 연구가 많이 진행되어 있지 않기 때문에 본 연구에서는 강원도, 울진 및 양구 산양증식복원센터에 존재하는 산양의 유전적 다양성 확인 및 성 판별을 위한 새로운 유전자를 발굴하기 위하여 수행되었다. 각 지역 내 산양 개체군들의 유전적 다양성을 확인하기 위하여 7가지의 microsatellite marker를 사용하였으며, DEAD-box helicase 3(DDX3) 유전자를 사용하여 성 판별을 하였다. 연구 결과, 사용된 marker들은 multiplex PCR을 통하여 정상적으로 증폭되는 것을 확인하였고, Microsatellite tool kit를 이용하여 HE, HO값을 평가하였을 때 강원지역 산양에서 두 값 모두 0.59로 높게 측정되었고 PIC값은 0.51로 두 지역보다 비교적 높았다. 또한 FSTAT version. 2.9.4를 이용하여 구한 AR값은 3.13으로 역시 강원지역에서 비교적 높게 나타났다. Fis값의 경우에는 특이적으로 울진지역이(-0.060) 강원 지역 (0.011)보다 낮게 나타났다(울진, -0.060; 강원, 0.011). 성 판별을 위해 이전에 보고된 두 종류의 Amelogenin (AMEL) primer set(SE47/48 및 SE47/53)를 사용한 결과 SE47/53 primer는 암컷과 수컷 모두 비 특이적인 band 양상을 보였고, SE47/48은 암컷개체에서는 단일 band를 보였으나, 수컷에서는 3개의 band를 나타냈다. 반면 DDX3_1을 사용하였을 시 암컷개체에서 1 band를 보였고, 수컷에서는 뚜렷한 2 band를 확인하였다. 다양한 샘플(조직, 혈액 및 분변)에서 SE47/48과 DDX3_1을 이용하여 성 판별을 진행한 결과, 조직과 혈액 샘플에서는 두 primer set 모두 정상적으로 확인되었으나, 분변 샘플에서는 DDX3_1이 더 선명한 밴드를 보였으며, 성공률이 높게 나타났다. 또한 산양에서 DDX3의 부분적 염기서열을 진행한 결과 소(Bos taurus)와 매우 유사한 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로 외부로부터의 유입없이 파편화된 서식지와 제한된 집단은 유전적 다양성의 감소를 통하여 멸종의 위험을 높일 수 있기 때문에, 야생산양의 보존을 위해서 지속적인 유전적 다양성의 관찰이 필요할 것으로 생각된다. 또한 산양의 성 판별을 위하여, AMEL유전자보다 DDX3유전자가 분변과 같은 비 침습적인 시료를 이용하여 성 판별을 하는데 더 적합하다고 판단된다.

Internationally, long-tailed goral (Naemorhadus caudatus) are classified as vulnerable. Moreover, they are designated as a Natural Monument Species No. 217 in South Korea. In 1960, large number of long-tailed goral were decreased by heavy snow and hunting. Recently, their population were recovered approximately 800 individuals, however, they were observed in limited regions. Limited habitat could promote extinction by increased inbreeding via reduction of genetic diversity and sex ratio is involved in extinction of species. Thus, continuous observation of genetic diversity and sex ratio is important for conservation of long-tailed goral. However, researches regarding with genetic diversity and sex identification are insufficient. Therefore, this study was conducted to observe genetic diversity of long-tailed goral in different regions [Gangwon-do, Uljin and Korean goral restoration center (KGRC)] and to develop new gene for sex identification. Genetic diversity of long-tailed goral from different regions was analyzed using 7 microsatellite markers and DEAD-box helicase 3 (DDX3) gene was used for sex identification. In results of genetic diversity, 7 microsatellite markers were successfully amplified by multiplex PCR. As genetic diversity parameters, observed heterozygosity (HO), expected heterozygosity (HE), allele richness (AR), and PIC in long-tailed goral from Gangwon were higher than other regions (HO and HE, 0.59; AR, 3.13; PIC, 0.51). Although genetic diversity is higher in goral from Gangwon, inbreeding coefficient (Fis) was lowest in goral from Uljin (-0.060). In results of sex identification, SE47/53 primer set for amelogenin (AMEL) gene showed unspecific bands in both of sex chromosomes. In case of SE47/48 primer set, 1 band and 3 band were detected in female and male, respectively. On the other hand, 1 band in female and 2 band in male were clearly detected by DDX3 primers. Sex determination from tissue and blood DNA samples were completely identified by SE47/48 and DDX3 primers, whereas DDX3 primer showed more clear band and higher success rate than SE47/48 primer in feces samples. Also, partial sequence of DDX3 in long-tailed goral was similar with bovine DDX3. In conclusion, because habitat fragmentation and limited population without influx from outside could increase risk of extinction, continuous observation of genetic diversity is needed for conservation of wild long-tailed goral. Also, DDX3 gene is suitable for sex identification using samples from wild animals such as feces.

Ⅰ. 서론 1
1. 긴꼬리 산양 (Naemorhedus caudatus) 1
2. 산양의 국내 현황 4
3. 유전적 다양성 5
4. 성 판별 6
Ⅱ. 재료 및 방법 9
1. 시료 수집 9
2. Genomic DNA 추출 9
3. Multiplex PCR 11
4. 대립유전자 결정 11
5. 유전적 다양성 분석 14
6. PCR을 이용한 성 판별 14
7. 부분 염기서열 분석 14
Ⅲ. 결과 17
1. 지역 내 산양의 유전적 다양성 17
2. 성 판별을 위한 DDX3 및 AMEL의 비교 23
Ⅳ. 고찰 30
Ⅵ. 참고문헌 35
Summary in English 41
감사의 글 44

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