본 연구에서는 녹용의 부산물인 녹각을 이용한 고부가가치 건강소재개발을 위해서 젖산발효 최적화를 수행하였다. 따라서 기존 녹각이 가지고 있는 효능과 더불어 유익한 생리적 기능과 함께 발효를 통해 부가가치를 높이며 항산화 및 생리활성평가를 통해 기능성 소재를 확인하였다.
녹각 5%를 auto clave, 한약추출기, 약탕기 세 가지 추출조건에서 한약추출기의 추출물이 고형분 및 단백질 함량은 각각 1.75%, 980 μg/mL로 가장 높은 것으로 나타났으며 주요 아미노산인 glycine 1943 μg/mL, proline 3405 μg/mL, glutamine 1641 μg/mL을 포한하여 총 아미노산 함량 13659 μg/mL로 가장 높게 나타났다. 한약 추출기의 추출물을 이용하여 MSG 1.5%, glucose 1.5%, YE 0.5%를 첨가하고 L. plantarum EJ2014 균주를 첨가한 후 30℃에서 7일간 젖산발효 하였을 때, pH 4.40, 산도 1.10%, 2.0×108 CFU/mL로 높은 생균수를 유지하는 것으로 나타났으며 약 1% GABA 함량을 함유하는 것으로 나타났다.
녹각 추출물을 이용하여 GABA 생산 최적화를 위해 질소원인 YE, 탄소원 glucose, GABA 생성 전구물질 MSG 농도에 따른 최적조건으로 YE 0.5%, glucose 1.5%, MSG 3.5%를 첨가하여 30℃에서 7일간 젖산발효를 하였다. 그 결과, 발효 7일 pH 6.56, 산도 0.77%, 2.0×108 CFU/mL로 높은 균수를 유지하는 것으로 나타났으며, GABA 1.4% 생성되는 것으로 나타났다.
GABA생성 최적조건에서 probiotics 및 기능성 강화를 위해 목이버섯을 2.5% 첨가하여 30℃에서 7일간 젖산발효를 하였다. 발효 7일 pH 5.06, 산도 0.77%로 나타났으며 1.3×108 CFU/mL로 높은 균수를 유지하였고 GABA를 1.4% 생성하는 것으로 나타났다. 목이버섯을 첨가했을 때 젖산균 발효물의 물성이 개선되며 단기간에 고농도의 GABA를 생성하는 것으로 나타났다.
녹각 젖산발효물에 항산화 활성 실험에서는 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 라디칼 소거활성에 미치는 영향을 분석하였다. 발효 전, 후 총 폴리페놀 함량은 각각 22.6 mg/mL, 21.62 mg/mL로 유의적인 차이는 없었으며, 플라보노이드 함량은 각각 10.90 mg/mL, 17.36 mg/mL으로 발효 후 증가하는 것으로 나타났다. DPPH와 ABTS 라디칼 소거활성은 50%의 라디칼 소거율을 나타내는 IC50로 나타내었으며, 그 결과 DPPH 라디칼에 대한 발효 전, 후 각각 IC50 0.17 mg/mL, 0.07 mg/mL로 나타났으며, ABTS 라디칼에 대한 발효 전, 후 IC50 2.83 mg/mL, 2.83 mg/mL로 나타났다.
녹각 젖산발효물의 DPPH와 ABTS 라디칼 소거활성은 50%의 라디칼 소거율을 나타내는 IC50로 나타내었으며, 그 결과 DPPH 라디칼에 대한 발효 전, 후 각각 IC50 0.12 mg/mL, 0.16 mg/mL로 나타났으며, ABTS 라디칼에 대한 발효 전, 후 각각 IC50 2.62 mg/mL, 2.71 mg/mL로 나타났다. 녹각추출액에 목이버섯을 첨가한 후 젖산발효물에 항산화 활성 실험에서는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, 라디칼 소거활성에 미치는 영향을 분석하였다. 발효 전, 후 총 폴리페놀 함량은 각각 19.40 mg/mL, 22.55 mg/mL로 약간 증가하였으며, 플라보노이드 함량은 각각 18.25 mg/mL, 13.69 mg/mL로 약간 감소하는 것으로 나타났다.
녹각 추출액의 목이버섯 첨가 유무에 따른 젖산발효물의 세포 생존율을 실험한 결과 목이버섯 0% 조건에서 발효 전, 후 0.6-6 mg/mL의 농도에서 세포독성이 나타나지 않았으며, 목이버섯 2.5% 조건에서 발효 전 6 mg/mL에서 독성이 나타났으나 발효 후 독성이 완화되는 것으로 나타났다. 따라서 발효를 통해 독성완화 효과를 가지는 것으로 나타났다. NO 생성 억제효과 결과 목이버섯 0% 조건에서 발효 전 6 mg/mL 농도에서 30.91 μM로 나타났으며, 발효 후 6 mg/mL 농도에서 32.04 μM로 NO 생성이 감소되는 것으로 나타났으며, 양성대조군 보다 감소했으나 발효에 따른 NO 생성의 큰 차이는 없었다. 목이버섯 2.5% 조건에서 발효 전 4 mg/mL 농도에서 24.01 μM로 감소하였으며, 6 mg/mL 농도에서는 대조군과 동일하게 NO 생성이 저해되는 것으로 나타났으나, 이는 세포독성으로 인해 NO생성이 저해되는 것으로 사료된다. 발효 후 4 mg/mL 농도에서 17.75 μM로 감소하였으며, 6 mg/mL 농도에서는 5.58 μM로 발효 후 NO 생성이 감소되는 것으로 나타났다.
결론적으로 녹각을 추출하여 젖산균을 이용한 단일발효를 통해 단기간에 고농도의 GABA 생산이 가능하였으며, 젖산발효물은 세포독성 완화 효과 및 NO 생성을 저해하는 것으로 나타났다. 따라서 기존녹각의 효능과 더불어 젖산균 발효를 통한 고농도 GABA 생산, 독성완화효과 및 NO 생성 저해 효능을 가지는 기능성 소재로 이용이 가능할 것으로 기대된다.

In this study, the optimization of lactic acid fermentation was conducted to develop a high value added health material using an old antler, a by-product of harts horn. Therefore, its added value was increased through fermentation with beneficial efficacies of old antlers, and the functional materials were confirmed through the finding of anti-oxidation and bioactive properties.
In the extracting conditions of an auto clave, an herbal extractor, and a boiling pot for 5% (w/v) old antlers, the extracts from the herbal extractor showed the highest contents of solids and proteins at 1.75% and 980 μg/mL and showed highest total amount of amino acid contents of 13,659 μg/mL, including major amino acids - 1,945 μg/mL of glycine, 3,405 μg/mL of proline, and 1,641 μg/mL of glutamine. In the extracts from the herbal extractor with 1.5% MSG, 1.5% glucose, and 0.5% YE the lactic acid fermentation was conducted by L. plantarum EJ2014 at 30℃ for 7 days. The fermented extract showed high viable cell counts of 2.0×108 CFU/mL, with pH 4.40, acidity of 1.10%, and 1% GABA.
To optimize the GABA production using the extracts of old antlers lactic acid fermentation was performed in the optimal conditions including 0.5% YE, 1.5% glucose, and 3.5% MSG at 30℃ for 7 days. As a result, high viable cell counts were maintained as pH 6.56, 0.77% of acidity, 2.0×108 CFU/mL, and 1.5% GABA on the 7th day of fermentation.
To enhance probiotics and functionality under optimal conditions of GABA production, lactic acid fermentation was conducted at 30℃ for 7 days with the addition of 2.5% AAJ. On the 7th day of fermentation, it showed pH 5.06 and an acidity of 0.77%. Also it maintained high viable counts of 1.3×108 CFU/mL and produced 1.4% of GABA. Furthermore, when AAJ was added, the physical properties of the fermented extract was improved, and a high concentration of GABA was produced in a short period.
For antioxidant activity experiments of old antler lactic acid fermented products, the total amount of polyphenol and flavonoid content and radical scavenging activity were analyzed. Before and after fermentation, the total polyphenol contents were 22.6 mg/mL and 21.62 mg/mL, respectively, implying that there is no significant difference. On the other hand, the flavonoid contents increased after fermentation from 10.90 mg/mL to 17.36 mg/mL. The DPPH and ABTS radical scavenging activity were expressed as IC50, which indicates a 50% radical scavenging rate. As a result, IC50 values before and after fermentation of DPPH radicals were observed as 0.17 mg/mL and 0.07 mg/mL, respectively. Further, the IC50 values before and after fermentation of ABTS radicals were 2.83 mg/mL and 2.83 mg/mL.
The radical scavenging activities of DPPH and ABTS of old antler lactic acid fermented products were also expressed as IC50. The values of before and after fermentation for DPPH radicals were 0.12 mg/mL and 0.16 mg/mL, and those of before and after fermentation for ABTS radicals were 2.62 mg/mL and 2.71 mg/mL. After adding AAJ to old antler extracts, an experiment of anti-oxidative activity of lactic acid fermented product involved total contents of polyphenol and flavonoid and the effects on radical scavenging activity was conducted. The total polyphenol contents before and after fermentation increased slightly to from 19.40 mg/mL to 22.55 mg/mL, whereas flavonoid contents decreased slightly from 18.25 mg/mL and 13.69 mg/mL.
In the experiment of cell viability of lactic acid fermented product according to the addition of AAJ, there was no cytotoxicity at the old antler concentration of 0.6-6 mg/mL before and after fermentation at 0% AAJ, and there was cytotoxicity at the concentration of 6 mg/mL AAJ before fermentation, but became moderated after fermentation. Thus, the results showed that the fermentation reduced the toxic effect. The inhibitory effect of -NO generation was 30.91 μM at 6 mg/mL before fermentation at 0% AAJ and the creation of NO diminished to 32.04 μM at 6 mg/mL AAJ after fermentation. The NO production of 32.04 μM decreased compared to a positive control group, but there was no significant difference in the production of NO by fermentation. The creation of NO decreased to 24.01 μM at 4 mg/mL old antler before fermentation with 2.5% of AAJ, showing that the creation of NO was inhibited equivalent to a control group. However, the decline in the creation of NO was interpreted as being due to the cytotoxicity. After fermentation, the production of NO dropped to 17.75 μM at 4 mg/mL, and to 5.58 μM at 6 mg/mL in the old antler after fermentation.
In conclusion, it was possible to produce a high concentration of GABA in a short period of single fermentation by a lactic acid bacterium with old antler extract, and the cytotoxicity of fermented old antler extract was moderated while the creation of NO was inhibited. It is expected that lactic acid fermented old antlers can be used as a functional material with a high concentration of GABA, the alleviation effect of cytotoxicity, and an inhibition effect against NO.