골은 골을 흡수하는 파골세포(osteoclasts)와 골을 형성하는 조골세포(osteoblasts)의 조절에 의해 형성되며 이 두 세포 간의 조절이 적절히 유지되면 뼈를 건강한 상태로 유지할 수 있지만 반대로 균형이 무너지면 골다공증을 비롯한 다양한 골 질환을 초래한다. 뼈를 형성하는 조골세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells:MSCs)로부터 분화되며 bone morphogenetic protein-2(BMP-2)와 같은 인자에 의해 조골세포로의 분화가 촉진된다. 조골세포에서 BMP-2는 Smads 신호전달체계를 통해 homeodomain을 가진 전사인자인 Distal-less homeobox 5(Dlx5)의 발현을 촉진시킨다. 증가된 Dlx5는 Runt-related transcription factor 2(Runx2) 또는 osterix(Osx)의 발현을 촉진시키고 이는 alkaline phosphatase(ALP), bone sialoprotein(BSP), osteocalcin(OC) 등의 발현을 증가시켜 석회화를 일으킨다. 한편, 모든 생물체는 각각의 생체주기(biological rhythm)를 가지고 있으며 그 중 약 24시간을 주기로 나타나는 생물학적 리듬을 일주기 리듬(circadian rhythm)이라 한다. 인체는 일주기 시스템(circadian system)을 통해 외부 환경의 변화에 체내 생체리듬을 동기화시킴으로써 일주기리듬을 조절한다. 인간을 포함한 포유류의 일주기 생체리듬의 중추는 뇌시상하부의 시신경교차상핵(suprachiasmatic nucleus:SCN)에 존재하며, SCN에 존재하는 중추 생체시계는 말초시계에 신호를 전달하여 일주기 리듬을 동조화한다. 생체주기의 분자적 기전은 CLOCK와 BMAL1에 의해 가장 상위 단계가 조절되며, 이들은 CLOCK/BMAL1 단백질 이형이합체(heterodimer)를 형성하여 Periods(Pers) 유전자, Cryptochromes(Crys) 유전자와 같은 하위 단계 유전자를 발현시킨다. 이에 의해 발현된 PER와 CRY 단백질은 핵으로 들어가 BMAL1/CLOCK 이형이합체의 기능을 억제함으로써 전사-번역 음성 되먹임 고리(transcription-translation negative feedback loops)를 통하여 주기를 이루게 된다. 최근에 보고된 연구 결과에 따르면 Bmal1은 간에서는 인슐린 감수성을 조절하고 지방 신생합성을 촉진하며 지방세포에서는 갈색지방 세포의 형성을 조절하는 것으로 보고되었다. 이처럼 다양한 조직에서 생체주기와 관련된 연구결과가 보고되고 있으나 골세포와 생체주기의 상관관계에 관한 연구는 아직 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 인슐린이 조골세포의 분화 마커 유전자를 조절함에 있어 생체주기 유전자인 Bmal1이 관여하는 지 확인하고자 조골모세포인 MC3T3-E1 세포에 인슐린을 처리하여 Bmal1 유전자와 단백질의 발현을 조사하였으며 Bmal1 유전자 과발현에 의한 영향을 분석하였다. 그 결과, MC3T3-E1 세포에서의 인슐린 처리는 조골세포 분화 마커 유전자의 발현을 증가시킴과 동시에 Bmal1의 발현 또한 증가시킴을 PCR 및 Western blot 분석으로 확인하였다. 다음으로 Bmal1의 효과를 확인하기 위하여 Bmal1 유전자를 세포에 과발현시켜 분석한 결과, OC 유전자를 비롯하여 조골세포 분화 초기 마커 유전자로 알려진 Id1 및 Runx2의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 이 결과들을 바탕으로 Bmal1이 Id1 및 Runx2의 발현뿐만 아니라 이를 조절하는 BMP2의 발현에도 영향을 주는지 확인해보았다. 그 결과, BMP2의 전사활성 및 발현 수준이 Bmal1에 의하여 확연히 증가함을 luciferase 분석 및 PCR 분석 방법으로 확인하였다. 이들 조절 기전을 재확인하기 위하여 Bmal1 knock out 세포를 실험에 이용하였다. 정상세포에서는 인슐린 처리에 의하여 BMP2 유전자의 발현이 증가하는데 반하여 Bmal1 knock out 세포에서는 BMP2의 발현이 증가하지 않음을 확인하였다. 또한 Alizarin Red S 염색을 통한 석회화 정도의 분석에서도 정상세포에서는 BMP2에 의한 염색 수준이 증가하는데 반하여 knock out 세포에서는 칼슘 침착을 통한 석회화가 증가하지 않았다. 이상의 결과를 요약하면, 일주기 조절 인자의 하나인 Bmal1은 조골세포에서 인슐린 신호에 의하여 조절되어 BMP2의 전사활성을 증가시킴으로서 조골세포의 분화를 촉진한다는 것을 증명한 것이다.

Bone homeostasis is maintained by a balance between bone resorption by osteoclasts and bone formation by osteoblasts. Excessive activation of osteoclast induces bone diseases such as osteoporosis. Osteoblasts originate from a mesenchymal stem cells (MSCs), and their differentiation is controlled by many growth factors, cytokines and environmental factors. Bone morphogenetic proteins (BMPs) are multifunctional cytokines that play important roles in various cellular functions. In osteoblasts, BMP2 stimulates osteoblast differentiation by activating smad1/5/8, which regulates expression of osteogenic markers such as distal-less homeobox 5 (Dlx5), Runt-related transcription factor 2 (Runx2), osteocalcin (OC) and bone sialoprotein (BSP). The mammalian circadian rhythms regulate many different metabolic process. The control of circadian rhythms is regulated by endogenous clocks in the suprachiasmatic nucleus (SCN) in the brain. The master clock in SCN synchronizes the phase of peripheral clock which regulate tissue-specific physiological outputs. BMAL1/CLOCK protein heterodimer induces transcription of Periods (Pers) and Cryptochromes (Crys) which in turn block the transcriptional activity of BMAL1/CLOCK. Several studies have shown that insulin is associated with bone metabolism. In addition, recent studies show that Bmal1 regulates metabolic processes in several peripheral tissue. However, the correlation of circadian rhythm between osteoblasts remains unclear. To investigate whether Bmal1 is associated with insulin-induced osteogenic genes, this study examined mRNA and protein expression of Bmal1 by insulin in MC3T3-E1 cells. Both osteogenic genes and Bmal1 mRNA expression were increased by insulin treatment in MC3T3-E1 cells. Insulin-induced upregulation of Bmal1 protein level was determined using western blot analysis. To investigate the effect of Bmal1, MC3T3-E1 cells were transiently transfected with pCMV-Bmal1. Overexpression of Bmal1 increased expression of osteogenic genes including Id1, Runx2, expressed at the early stage of osteogenesis and OC which suggest that Bmal1 may regulates factor at an earlier stage of osteoblast differentiation. As expected, both transcriptional activity and mRNA expression of BMP2 were markedly increased by Bmal1. Moreover, in contrast to insulin induced BMP2 in wild type (WT) cells, insulin-induced BMP2 expression was attenuated in Bmal1 knockout (KO). In addition, the result of alizarin red S staining showed that BMP2-induced calcium deposition was increased in WT cells. In contrast, KO cells were not affected by BMP2-induced calcium deposition. Taken together, these results demonstrate that Bmal1 promotes osteoblast differentiation through insulin-induced upregulation of BMP2 transcriptional activity.