한식의 세계화를 도모하기 위해서 우리 고유의 전통발효식품 중 하나인 발효식초에 대해 이들을 새로운 기능성 식품소재로써의 이용 가능성을 제시함과 동시에 전통발효식초의 우수성을 규명하고자, 4종의 국내산 전통발효식초와 2종의 해외산 발효식초를 포함한 6종의 발효식초들을 대상으로 고분자 다당을 분리하여 화학적 특성과 면역증진활성을 평가하였다.
국내산 전통발효식초 4종[사과식초(KAV-0), 와인식초(KWV-0), 현미식초(KBV-0), 감식초(KPV-0)]와 해외산 발효식초 2종[영국와인식초(UWV-0), 일본현미식초(JBV-0)]으로부터 EtOH 침전법에 의해 다당을 분리하고, 다당 시료의 수율, 화학적 특성 및 면역활성을 비교 및 검토한 결과, 활성 및 수율이 상대적으로 우수한 3종의 다당인 KBV-0, JBV-0 및 KPV-0를 선정할 수 있었다. 이들을 대량 조제하여 제반 화학특성을 살펴본 결과 KBV-0와 JBV-0는 발효 미생물 유래 mannan을 주성분으로, KPV-0는 발효의 원재료인 감으로부터 유래된 pectin을 주성분으로 함유함을 확인하였다. 각 시료는 β-glucosyl Yariv reagent와 반응성을 보임으로써 type II arabinogalactan이 일부 함유되어 있음을 확인하였다.
발효식초 유래 3종의 다당시료는 mouse 복강의 macrophage와 Raw 264.7 cell 그리고 Caco-2 cell에 대해 세포독성이 없음이 확인되었으나, 이들은 모두 대식세포를 자극하여 NO, IL-6, IL-12 및 TNF-α 등의 생산을 농도의존적으로 증가시켰는데, 특히 KPV-0의 활성이 상대적으로 가장 우수하였다. 또한, KPV-0는 높은 FcRII 발현 촉진활성을 갖고 있었다. 한편 KBV-0와 JBV-0 및 KPV-0는 장관면역 Peyer''s patch cell을 자극하여 IL-6의 생산을 촉진시켰다. 또한 골수세포 증식능에서 상대적으로 우수한 활성을 보였다. 한편, KPV-0의 경우 Peyer''s patch cell을 3종의 발효식초 유래 다당시료는 Peyer''s patch 내 Treg 세포를 활성화하여 TGF-β의 생합성을 촉진시키고, IgA의 생산을 농도의존적으로 증가시켰는데, 특히 KPV-0가 가장 우수한 활성을 보였다. 또한 Transwellⓡ이 장착된 배양기를 이용한 실험에서 KPV-0는 장관상피세포를 통과하여 면역세포에 작용할 수 있음을 확인하였다.
각종 장관면역활성과 수율이 양호했던 KBV-0와 KPV-0를 각각 3개의 획분으로 정제를 진행하고 순도와 분자량을 확인하였으며, 3개 다당을 회수하고 일반 화학특성 및 구성당을 분석하였다. 국내산 현미식초로부터 정제된 KBV-I, KBV-II 및 KBV-III 3개 다당 획분은 각각 분자량 60 kDa, 10 kDa 및 3 kDa의 다당체임이 확인되었으며 세 획분 모두 90%이상의 높은 중성당 함량을 보이고 3.1~9.6%의 산성당 함량을 나타냄으로써 이들이 주로 중성 다당체로 존재함을 확인할 수 있었다. 현미식초 유래 활성 정제 다당인 KBV-I은 발효 중 효모의 세포벽에서 기원하는 mannan으로 구성되어 있음을 확인하였다. 한편, 국내산 감식초 유래 정제 다당은 KPV-I, KPV-II 및 KPV-III의 분자량은 60 kDa, 10 kDa 및 5 kDa로 평가되었으며 62.8~85.4%의 중성당 함량과 14.6~37.2%의 산성당 함량을 나타냄으로써 이들이 원료인 감 유래의 pectic polysaccharide로 구성되어 있음을 추정할 수 있었다.
정제다당들은 모두 면역관련 세포에 대해 독성을 나타내지 않았으며, 대식세포를 자극하여 NO 생성을 촉진하였다. 하지만 현미식초 유래 정제다당보다는 감식초 유래 정제다당의 활성이 상대적으로 우수하였다. 현미식초 유래 정제다당들은 모두 대식세포를 자극하여 IL-6, IL-12 및 TNF-α의 생성을 농도 의존적으로 증진시켰으며, 그 중 고분자 다당인 KBV-I이 가장 높은 활성을 보였다. 하지만 감식초의 경우 KPV-I만이 높은 IL-6, IL-12 및 TNF-α의 생산 증진 활성을 나타내었다.
가장 양호한 면역증진활성을 보였던 KBV-I과 KPV-I은 methyl화 분석에 의해 활성에 공헌하는 전체 구조를 예측하였다. KBV-I의 경우, 총 25종의 당쇄 결합이 검출되었고, 구성당 조성 및 당쇄 결합양식의 특성으로 미루어 약 60%이상의 높은 비율로 존재하는 mannan [(1,6)결합 mannose 주쇄에 C2위치에서 mannose 측쇄연결]과 약 30%의 비율을 차지하는 pectin 유래의 rhamnogalacturonan I (RG-I) 그리고 10% 미만으로 존재하는 전분 및 효모의 β-glucan 유래의 glucan으로 존재함을 확인하였다. 또한 KPV-I의 경우, 총 21종의 당쇄 결합으로 구성되어 있었으며, 약 70%의 높은 비율로 존재하며 측쇄에 arabino-(3,6)-galactan을 소유한 RG-I과 약 20% 비율 효모 세포벽 유래의 mannan, 그리고 약 10% 정도로 존재하는 감 유래 β-glucan을 함유하고 있음이 확인되었다.
전통발효식초의 유래 다당의 경구 투여가 Peyer''s patch cell의 IgA 및 cytokine 생산에 미치는 효과를 확인하기 위해 KBV-0와 KPV-0를 각각 0, 50, 500, 5,000 μg/mouse/day의 농도로 1일 1회 총 20일간 경구투여 하여 검정하였다. 그 결과, KBV-0 및 KPV-0의 경구투여는 Peyer''s patch에 의한 IgA 항체의 생산량을 증가시켰으며 IgA의 생산과 관련된 cytokine류인 IL-6, GM-CSF 및 TGF-β의 분비를 유의적으로 증가시켰으며, 투여량에 의존적으로 생산 촉진 활성을 보였다(ex vivo). 한편 경구 투여가 소장내액 및 분변 중 분비는 IgA 함량에 미치는 효과를 검토하기 위해 0, 50, 500 5,000 μg/mouse/day 의 농도로 1일 1회 총 30일간 경구투여한 결과, KBV-0 및 KPV-0 투여군에서 투여량 의존적으로 소장내액 및 분변에서 IgA의 증가가 관찰되었다. 하지만 경구투여 효과는 KPV-0 투여군이 KBV-0 투여군에 비해 상대적으로 훨씬 우수한 것으로 나타났다. 이상의 결과는 국내산 전통발효식초에는 조미성분외에 면역활성이 우수한 특이 다당체를 함유하고 있으며, 이들 다당체들에 의해 인체의 건강 유지에 유용한 장관면역활성을 부여할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.

In order to elucidate the immuno-stimulating activity of traditional fermented vinegar, 6 kinds of crude polysaccharides (CP) were isolated from traditional fermented vinegars manufactured with different raw materials in domestic or foreign countries, and then their chemical properties and several immuno-stimulating activities were evaluated. Among six samples, three kinds of crude polysaccharides prepared from Korean brown rice vinegar (KBV-0), Japanese brown rice vinegar (JBV-0) and Korean persimmon vinegar (KPV-0) showed higher yields and interleukin (IL)-6 producing activities by macrophages and was selected for further studies.
Anti-complementary activities of KBV-0, KPV-0 and JBV-0 were increased dose-dependently but KBV-0 and KPV-0 showed higher anti-complement activity (62 and 65% of DIW control) than JBV-0 at 1,000 μg/mL. In an in vitro cytotoxicity analysis, KBV-0, KPV-0 and JBV-0 did not affect the growth of peritoneal macrophages, RAW 264.7 cells and Caco-2 cells. KBV-0, KPV-0 and JBV-0 significantly augmented the production of nitric oxide (NO), IL-6, IL-12 and TNF-α in a dose dependent manner as well as their mRNA expressions. However the activity of KPV-0 was the most potent in the tested polysaccharides. In order to assess phagocytosis activity, the effects of vinegar polysaccharides on mRNA expression of Fc receptor II (FcRII) was also determined by PCR products. Only KPV-0 showed enhanced expression of mRNA expression for FcRII by dose dependent manner whereas KBV-0 and JBV-0 did not affect the FcRII expression. In an in vitro assay for intestinal immune modulating activity, KBV-0, KPV-0 and JBV-0 augmented bone marrow cell proliferation through Peyer’s patch and the production of IgA and TGF-β by Peyer''s patch cells in a dose-dependent manner. However the activity of KPV-0 was more potent.
On the other hands, to identify and characterize the immuno-modulating ingredient of KBV-0 and KPV-0, they were further fractionated by Sephadex G-75 gel filtration chromatography. Three polysaccharide fractions (KBV-I, II and III) with different MWs were obtained from the crude polysacchride (KBV-0), and KPV-I, II and III were from KPV-0. The high molecular weight polysaccharide fraction, KBV-I was estimated as 60 kDa of MW and it mainly consisted of neutral sugar (96.9%) such as mannose (58.4%), galactose (12.1%) and Glc (13.3%). KPV-I was estimated as 60 kDa polysaccharide that consisted of neutral sugar (85.4%) such as arabinose (31.7%), mannose (19.6%) and galactose (15.2%), and uronic acid (14.6%). KBV-I and KPV-I were reacted with β-glucosyl Yariv reagent, suggesting the presence of an arabino-β-3,6-galactan moiety. All of the purified fractions did not affect the growth of peritoneal macrophages from BALB/c mice, RAW 274.7 murine macrophage cell lines or Caco-2 human epithelial colorectal cell lines. KPV-I showed a significantly higher production of NO and various cytokines such as IL-6, IL-12 and TNF-α from peritoneal macrophage of BALB/c mice than other fractions.
Methylation analysis indicated that KBV-I comprised 25 different glycosyl linkages and it existed as the mixture composed of three different polysaccharides such as mannan (60%), rhamnogalacturonan I (RG-I, 30%) and glucan (10%). A mannan residue in KBV-I contained several characteristic mannopyranosyl linkages such as terminal-, 2- and 2,6-linked Manp, suggesting mannan originated from the cell walls of yeasts. A RG-I residue in KBV-I was composed of rhamnogalacturonan core substituted with neutral carbohydrate side chains such as arabinan, galactan and arabinogalactans and related oligosaccharides. It supposed that the potent immuno-stimulating activity of KBV-I may be due to the mannan from yeast cell walls and RG-I from the pectin of brown rices which was released during fermentation process. On the other hand, KPV-I contained 21 different glycosyl linkages, suggessing the mixture composed of three different polysaccharides such as rhamnogalacturonan RG-I (70%), mannan (20%), and glucan (10%). A RG-I residue in KPV-I comprised several glycosidic linkages such as 5-linked Araf, 3-linked Galp and 2,4-Rhap, being characteristic glycosidic linkages in RG-I region of pectin. A mannan residue in KPV-I contained several characteristic mannopyranosyl linkages such as terminal-, 2- and 2,6-linked Manp, expecting mannan originated from yeast cell wall. It also supposed that the potent activity of KPV-I may be mainly due to the yeast mannan and persimmom RG-I.
To investigate the in vivo effects of polysaccharides isolated from traditional fermented vinegars on the intestinal immune system modulating activity, KBV-0 and KPV-0 were administered orally into the mice of each four experimental groups (0, 50, 500 and 5,000 μg/mouse/day, 20 days). In this results, oral administration of KBV-0 and KPV-0 induced the increased production of not only IgA but also various cytokines (IL-6, GM-CSF and TGF-β) by Peyer’s patch cells, in a dose dependent manner. Also, the groups fed with KBV-0 and KPV-0 markedly increased the IgA production into intestinal fluids and feces. However, oral administration of KPV-0 was more effective at the same dosages than that of KBV-0. On the other hand, IL-6 and GM-CSF secretion in serum did not show significant increase in the groups fed with KBV-0 and KPV-0 in comparison with negative control (NC, water administrated group). Above data lead us conclude that Korean traeitional vinegars contains select polysaccharides in addition to seasoning components, and these polysaccharides appear to provide intestinal immune-stimulating activities beneficial to human health.