본 연구에서는 버섯 곰팡이 Ceriporia lacerata 균사체 액체 배양을 최적화한 후, 김치 젖산균의 혼합발효를 통해서 다당류, β-glucan과 같은 생리활성물질과 기능성 GABA 생산을 극대화하고자 하였다.
세리포리아 균사체의 최적 배양 조건으로 glucose 3%, soybean flour 3%, MgSO4 0.15%를 혼합한 기본 배지에 미강 5%를 첨가하여 25℃, 160 rpm, 7일간 flask에서 진탕 배양하였다. 그 결과, 배양 7일 후, 균사체 함량 49.6 g/L, 다당류 함량 15.5 g/L, β-glucan 함량 31.4% (w/w)로 매우 높게 나타났다. 효소활성을 측정한 결과, protease 활성 45.6 unit/mL, α-amylase 활성 18.95 unit/mL, cellulase 활성 4.1 unit/mL로 나타나 C. lacerata의 효소 활성이 매우 높은 것을 알 수 있다.
기본 배지에 FeSO4 0.5%를 첨가하여 25℃, 300 rpm, 7일간 5 L jar fermentor에서 진탕 배양하였을 때, 균사체 함량 29.7 g/L, 다당류 함량 4.1 g/L, β-glucan 함량 6.39% (w/w), protease 활성 8.24 unit/mL, α-amylase 활성 26.42 unit/mL을 나타내었다.
미강 5%를 첨가하여 배양한 C. lacerata 균사체 배양액을 이용하여 Lactobacillus plantarum K154 균주를 접종하고, sodium glutamate 2%와 skim milk 5%를 첨가하여 7일간 젖산발효를 하였다. 그 결과 배양 1일 후, pH 4.03, 산도 3.43%, 생균수 1.02×1010 CFU/mL로 매우 높게 나타났으며, 배양 7일 후 tyrosine 함량은 1,503.26 μg/mL로 나타났다. GABA 함량을 HPLC로 정량 분석한 결과, glutamic acid 함량이 배양기간 중 급격히 감소하여 82%가 GABA로 전환되어 1.5%의 GABA를 생성하는 것을 확인하였다. 또한 SDS-PAGE를 통해 젖산발효물을 분석한 결과, 배양 3일 째 40 kDa의 단백질이 생성되면서, 단백질의 염기서열을 분석한 결과, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)로 확인되었다.
5 L jar fermentor에서 기본배지를 이용하여 7일간 진탕 배양한 C. lacerata 버섯 균사체 배양액으로부터 GABA 생산을 위해 젖산균 고정화를 이용하여 혼합발효를 하였다. 생균수를 측정한 결과, alginate 용액의 농도에 따른 차이는 없었으며, 배양 1일 째 비드 내에서 젖산균수는 3.13×109 CFU/mL으로 높게 나타났고, 배지에 유리된 젖산균수는 배양기간 동안 1.48×108 CFU/mL으로 생균수가 일정하게 유지하였다. GABA 함량을 HPLC로 정량 분석한 결과, Alginate 1.5% 용액을 사용하였을 때, 배양 7일 째 비드 내에서 6.30 mg/mL, 배지에서 9.96 mg/mL의 GABA 함량이 나타났다. SEM을 통해 젖산균을 고정화한 Ca-alginate 비드의 표면과 단면을 관찰한 결과, 구형의 다공성 구조임을 확인하였다.
젖산균 고정화의 재사용 가능성을 보기 위해 3일간 발효 후 기존의 배지는 제거하고, 새로운 배지를 첨가하면서 5회간 혼합발효를 하였다. GABA 함량을 측정한 결과, 발효 1회 이후, 2회 때부터 GABA 생산이 급격히 증가하여 혼합발효 5회 동안 GABA 함량이 유지되었다. Ca-alginate 비드의 형태를 SEM을 통해 관찰한 결과, 비드의 표면은 담체가 치밀한 구조로 균체를 보호하고 있었고, 내부는 기공이 많이 형성되어 있었다.
젖산균 고정화의 인공 위액과 장액에 대한 내성실험을 하여 생균수를 측정하여 생존율을 확인하였다. 인공 위액 pH 2.0 조건에서 2시간 후 alginate 1.5% 용액으로 제조한 비드에서 24%의 생존율이 나타났고, alginate 3% 용액에서는 56%의 생존율을 보였다. 인공 장액 pH 7.5 조건에서 24시간 경과 후, alginate 1.5% 용액에서는 8%, alginate 3% 용액에서는 86%의 생존율이 나타난 것으로 보아 alginate 3% 용액으로 젖산균 비드를 제조하였을 때, pH 2.0에서 내성이 더 강하고, pH 7.5에서는 장시간 안정되어 젖산균의 생존율을 높일 것으로 판단되었다.
결론적으로 C. lacerata 균사체 액체 배양을 최적화 하고, 세리포리아 배양물로부터 L. plantarum K154 젖산균 고정화를 이용한 혼합발효를 통해서 GABA의 대량 생산이 가능하였다. 따라서 세리포리아 배양물의 다양한 생리활성물질을 포함하여 고농도 GABA가 증진된 기능성 소재를 생산할 수 있었으며, 이는 식품 및 생물 산업의 원료로 활용이 기대된다.

Optimal production of GABA was accomplished by co-cultivation using Ceriporia lacerata and Lactobacillus plantarum K154, with co-production of bioactive compounds including polysaccharides, β-glucan, peptides, and probiotics.
Optimization of C. lacerata mycelial culture was performed in a defined medium containing glucose 3%, soybean flour 3%, MgSO4 0.15% and rice bran 5% for 7 days at 25℃ in shaking culture. C. lacerata highly produced mycelia 49.6 g/L, exopolysaccharides 15.5 g/L, β-glucan 31.4% (w/w), protease 45.6 unit/mL, α-amylase 18.95 unit/mL and cellulase 4.1 unit/mL for 7 days, respectively.
The supplement of ferrous sulfate 0.5% in a submerged culture of C. lacerata resulted in the production of mycelia 29.7 g/L, exopolysaccharides 4.1 g/L, β-glucan 6.39% (w/w), protease 8.24 unit/mL, and α-amylase 26.42 unit/mL, respectively.
Co-cultivation enhanced the microbial GABA production in C. lacerata culture including skim milk 5% and sodium glutamate 2%. Lactic acid fermentation provided pH 4.03, acidity 3.43%, and viable cells of 1.02×1010 CFU/mL after fermentation for 1 day. Tyrosine content increased according to culture time, producing 1,503 μg/mL after 7 days. Further more, the GABA production was dramatically increased with 1.5% level. Additionally, a molecular weight protein 40 kDa was dominantly produced and was confirmed to be glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) by the protein sequencing.
GABA was also overproduced using immobilized L. plantarum K154 in the submerged culture of C. lacerata. Immobilized L. plantarum K154 in C. lacerata culture showed viable cell counts of 3.13×109 CFU/mL (immobilized cells) and 1.48×108 CFU/mL (free cells) after fermentation for 1 day. The GABA production in cells immobilized with alginate 1.5% were 6.30 mg/mL (immobilized cells) and 9.96 mg/mL (free cells), respectively. The surface of Ca-alginate bead in alginate 3% showed the globular form with porous structure by SEM.
The recycling test of immobilized L. plantarum K154 in the C. lacerata culture was consequently performed five times at 30℃ for 15 days. Continuous lactic acid fermentation using immobilized L. plantarum K154 showed the highest GABA production with the supplement of fresh culture medium at recycling time. After continuous production of GABA, LAB cells in a Ca-alginate bead were still entrapped.
Immobilized L. plantarum K154 was subjected to the simulated gastric juice (pH 2.0) and intestinal juice (pH 7.5) to confirm their resistance. The alginate 1.5% bead showed a survival rate of 24%, and the alginate 3% bead showed a survival rate of 56% in pH 2.0 after 2 hrs. The alginate 1.5% bead showed an 8% survival rate and the alginate 3% bead showed the highest survival rate of 86% in pH 7.5 after 24 hrs. The results showed that L. plantarum K154 immobilized using alginate 3% showed higher viable bacterial cells in simulated gastric and intestinal juices.
In conclusion, optimization of C. lacerata mycelial culture was successfully accomplished and overproduction of GABA was performed by co-cultivation using L. plantarum K154. Thus, it is expected that fermented ingredient including various bioactive compounds and GABA can be used as novel ingredients for food and biomaterial industries.