현초(玄草)로부터 분리된 페놀성 화합물의 항비만 효과 및 다성분 동시분석을 위한 UPLC-DAD 방법의 개발 :Anti-obesity effect of phenolic compounds isolated from Geranium thunbergii Sieb. et Zucc. and development of UPLC-DAD method for their simultaneous analysis

김세건

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자료유형: 학위논문

저자정보: 김세건 (원광대학교, 원광대학교 대학원)

지도교수: 정현주

발행연도: 2013

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이용수2

이 논문의 연구 히스토리 (2)

2018

페놀성 화합물을 이용한 현지초의 UPLC 다성분 동시분석 개발

김세건 , 라미차네라마칸타 , 이경희 외 3명 생약학회지(Korean Journal of Pharmacognosy) 2018.03 학술저널

2013

현초(玄草)로부터 분리된 페놀성 화합물의 항비만 효과 및 다성분 동시분석을 위한 UPLC-DAD 방법의 개발

김세건 한약 2013.01 학위논문

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비만은 체내에 과잉된 에너지가 지방으로 축적되고, 대사성 질환을 야기하는 것으로 알려져 있다. 비만 치료를 위해서는 지방생성(adipogenesis)을 조절하는 것이 효과적인 방법으로 여겨지고, 식물에서 유래된 많은 항산화 물질은 in vitro와 in vivo 모델에서 항비만 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. 현초(Geranium thunbergii)는 전통적으로 아시아에서 이질을 치료하는데 널리 사용되었고, 강력한 항산화 활성을 가지는 것으로 문헌에 보고되어 있다. 이에 본 연구에서는 천연자원으로부터 항비만 활성을 가지는 소재를 개발하기 위하여 현초를 실험재료로 사용하였다. 현초의 메탄올 추출물로부터 용매 분획하여 얻어진 부탄올 분획은 OP9 전구지방세포에서 지방 축적 억제효과를 보였으며, 이 분획으로부터 활성물질을 규명하기 위하여 9개의 화합물을 분리하였다. 분리된 화합물은 이화학적인 방법을 통하여 (1D-NMR, 2D-NMR, MS) 구조를 동정하였고, 각각 kaempferitrin (1), kaempferol-3-O-α-7-rhamnoside (2), kaempferol-3-O-arabinofuranoside -7-rhamnoside (3), methyl gallate (4), protocatechuic acid (5), gallic acid (6), afzelin (7), ellagic acid (8), corilagin (9)으로 규명하였다. 고지방 식이로 유발한 비만 흰 쥐에서 항비만 활성을 알아보기 위하여 메탄올 추출물, 부탄올 분획, 화합물 1, 3, 8을 처리하여 활성을 측정한 결과, 부탄올 분획과 화합물 1, 3, 8을 처리한 군에서 체중감소와 혈중 내 중성지방을 억제하는 것을 확인하였고, 신장독성과 간독성 검사를 위하여 혈청에서 GOT, GPT, γ-GTP, BUN과 creatinine를 측정한 결과에서는 각 시료의 농도에서 어떤 독성도 관찰되지 않았다. 활성산소종에 의하여 발생되는 지질과산화와, 체내의 산화를 유발시키는 hydroxyl radical의 활성도 억제하였으며 항산화효소인 superoxide dismutase의 활성을 증가시켜 고지방식이로 유발한 비만 흰 쥐에서 항산화 활성을 가지는 것으로 확인 되었다. 또한 부탄올 분획으로부터 분리된 화합물을 지표로 하여 현초 메탄올 추출물 내에서 지표성분을 정량하기 위한 UPLC-DAD 방법을 개발하였고, 특이성, 직선성, 농도의 범위, 검출한계, 정량한계 및 일내/일간 정밀성을 평가하여 분석방법의 타당성을 확인하였다. 이상의 결과를 통해 현초 부탄올 분획의 항비만 효과는 이 분획에 함유되어 있는 페놀성 화합물들이 작용하여 활성을 나타내는 것으로 사료되고, 개발된 분석방법은 현지초의 화학적 품질관리를 위하여 충분히 적용될 수 있을 것이라 생각된다.

Obesity causes many metabolic disorders and is associated with an excessive accumulation of fat in the adipose tissue. The inhibition of adipogenesis has been considered as an effective treatment for obesity. Many Plants based anti-oxidant agents have been reported to show anti-obesity effect in vitro and in vivo models. Geranium thunbergii has been reported to have significant anti-oxidant activity and traditionally used for treatment of diarrhea in Asia. In this study the plant has been used as experimental material for development of anti-obesity agent as a natural source. The BuOH-soluble fraction of Geranium thunbergii showed inhibitory effect on lipid accumulation in OP9 cells. Thus, this fraction was investigated extensively and nine compounds were isolated. After the identification on the basis of spectroscopic method (1D, 2D-NMR and MS), they were found to be: kaempferitrin (1), kaempferol-3-O-α-7-rhamnoside (2), kaempferol-3-O-α-arabinofuranoside-7-rhamnoside (3), methyl gallate (4), protocatechuic acid (5), gallic acid (6), afzelin (7), ellagic acid (8), and corilagin (9). In vivo assay of compound 1, 3, 8, and BuOH fraction on high-fat-diet induced obese rats showed decreased body weight and serum triglyceride content. The levels of GOT, GPT, γ-GTP, BUN, and creatinine had no significant differences compared to control group. Also, the sample treated groups suppressed activity of lipid peroxidation which generated reactive oxygen species (ROS). Hydroxyl radical activity was also decreased in sample treated groups. The activity of superoxide dismutase (SOD) which eliminated ROS was increased in the sample treated group compared to control group. To quantify the content of active compounds from G. thunbergii, analytical method was optimized using UPLC-DAD and the method was validated by specificity, linearity, range, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), precision (intra and inter day variability), and accuracy (recovery). The results of in vivo assay indicate that compound 1, 3, 8, and BuOH fraction of G. thunbergii has anti-obesity activity. In addition to that the developed method of validation from the analytical study can be applied for the chemical quality control of G. thunbergii.

Ⅰ. INTRODUCTION 1
1. Geranium thunbergii Sieb. et Zucc. 1
2. Quality control of medicinal herbs 2
3. Analytical method validation 3
4. Obesity 7
4.1. Adipose tissue 9
4.2. Adipogenesis 10
5. Aim of this study 13
Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 14
1. Materials 14
1.1. Plant 14
1.2. Reagents and equipments 14
1.2.1. Reagents for chromatography 14
1.2.2. Reagents for bioassay 14
1.2.3. Equipments 15
2. Methods 16
2.1. Extraction, fractionation, and isolation 16
2.2. UPLC-DAD analysis of MeOH extract of G. thunbergii 22
2.2.1. Preparation of sample and standard solutions 22
2.2.2. Chromatographic condition 22
2.2.3. Method validation 22
2.2.3.1. Specificity 23
2.2.3.2. Linearity, limit of detection (LOD), and limit of quantification (LOQ) 23
2.2.3.3. Precision 23
2.2.3.4. Accuracy 23
2.3. Total polyphenol content 24
2.4. In vitro assay 24
2.4.1. Cell culture and differentiation 24
2.4.2. MTT assay 25
2.4.3. Oil red O staining 25
2.4.4. Statistical analysis 25
2.5. In vivo assay 26
2.5.1. Animals 26
2.5.2. Experimental groups 26
2.5.3. Biochemical analysis on blood 29
2.5.3.1. Triglyceride (TG) content 29
2.5.3.2. Total cholesterol (TC) content 29
2.5.3.3. High density lipoprotein cholesterol (HDL-C) content 29
2.5.3.4. Liver function test 30
2.5.3.5. Renal function test 30
2.5.3.6. Measurement of superoxide dismutase (SOD) activity 30
2.5.3.7. Lipid peroxidation (LPO) determination 31
2.5.3.8. Measurement of hydroxyl radical (HR) 31
2.5.3.9. Protein determination and statistical analysis 32
Ⅲ. RESULTS AND DISCUSSION 33
1. Structure identification 33
1.1. Compound 1 33
1.2. Compound 2 38
1.3. Compound 3 43
1.4. Compound 4 49
1.5. Compound 5 52
1.6. Compound 6 55
1.7. Compound 7 57
1.8. Compound 8 62
1.9. Compound 9 65
2. Development of analytical procedure by UPLC-DAD 70
2.1. Optimization of chromatographic conditions 70
2.2. Method validation for quantitative analysis 72
2.3. MGT analysis 73
3. Total polyphenol content 80
4. Cell experiment 81
4.1. Cell viability of OP9 cells 81
4.2. Oil red O staining of OP9 adipocyte 82
5. Animal experiment 84
5.1. Variation of body weight and food intake 84
5.2. Organ weight and adipose tissue weight 87
5.3. Lipid profiles of serum 89
5.4. Liver and kidney function test 91
5.5. Effect on lipid peroxidation (LPO), hydroxyl radical (HR), and superoxide dismutase (SOD) activities in serum 93
Ⅳ. SUMMARY 95
Ⅴ. REFERENCE 98

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