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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 발행연도
- 2013
- 저작권
- 경상대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수3
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두족류는 2005년 이래 현재까지 연간 약 33만 M/T를 생산하여 수산가공업에서 매우 중요한 위치를 차지하고 있는 수산물로 갑오징어, 오징어, 문어 등이 여기에 속한다.
두족류는 타우린 및 콜라겐 등과 같은 건강 기능성 성분이 풍부하고, 아미노산, 인 및 비타민 등과 같은 영양성분이 다량 함유되어 있으며, 특유의 조직감과 식미를 가지고 있어 오징어의 경우 마른 오징어, 조미 오징어, 오징어 젓갈, 식해 및 냉동식품 등과 같은 소재로, 갑오징어의 경우 전처리하여 여러 가지 요리의 소재로, 그리고 문어의 경우 조미 문어, 자숙 문어 등의 소재로 많이 이용되고 있다. 두족류는 다량 어획되어 여러 가지 가공품으로 제조 시에는 내장, 껍질, 자숙수, 연골 및 갑오징어갑 등과 같은 부산물이 다량 발생하고 있으며, 이들 부산물은 현재 사료와 같이 비효율적으로 이용되고 있거나 전량 폐기되어 환경 오염을 야기하고 있는 실정이다. 하지만, 두족류 부산물인 내장에는 건강 기능성 지질인 EPA와 DHA, 유용 효소 및 단백질이 다량 함유되어 있고, 껍질에는 콜라겐 및 이의 peptide들이 다량 함유되어 있으며, 자숙수에는 유용 맛성분들이, 연골에는 키토산의 소재인 키틴이, 그리고 갑오징어갑에는 유용 무기질인 칼슘이 다량 함유되어 있어 우수한 수산가공 재자원들이다. 따라서 두족류 가공 부산물을 앞에서 언급한 목적의 고부가 소재로 유용 이용할 수 있다면 수산가공자원의 효율적 이용에 의한 자원 문제 해결 측면 뿐만이 아니라 환경 오염원의 근원적 제거라는 사회적 문제도 해결할 수 있어 상당히 의의가 있다고 생각된다.
본 연구에서는 문어 가공 부산물인 간췌장 중 효소 추출 재자원과 같이 효율적 이용을 목적으로 문어 간췌장의 endoprotease 및 exopeptidase의 분포, 여러 가지 분획방법에 따른 특성, 쓴맛 가수분해물의 쓴맛 개선 효과 검토 및 AS-UF 공정에 따른 쓴맛 개선과 효소학적 특성 등에 대하여 검토하였다.
갑오징어, 오징어, 문어 두족류 가공 부산물인 간췌장을 효소제재로 이용하기 위하여 갑오징어, 오징어, 문어 간췌장의 endoprotease와 exopeptidase의 분포 특성에 대하여 살펴본 결과는 다음과 같다. 조효소가 함유되어 있으리라 추정되는 두족류 간췌장의 총 단백질 농도는 갑오징어 간췌장이 5,940 mg/100 g 으로 가장 높았고, 다음으로 오징어 간췌장(4,157 mg/100 g) 및 문어 간췌장(3,940 mg/100 g)의 순이었다.
두족류 간췌장 유래 조효소의 활성을 천연기질(azocasein)과 합성기질 (LeuPNA)로 나누어 살펴 본 결과 3종의 두족류 모두 천연기질의 분해 활성에 비하여 합성기질의 분해 활성이 높아, 두족류 간췌장으로부터 효소를 분리하여 이용하고자 하는 경우 exopeptidase에 초점을 맞추어야 하리라 판단되었다. 또한 exopeptidase를 두족류 간췌장으로부터 추출하고자 하는 경우 문어 간췌장이 갑오징어, 오징어 간췌장 보다 우수하다고 판단되어 이하 실험에서는 문어 간췌장을 이용하여 쓴맛 개선용 exopeptidase의 효율적 분획 방법에 대해 검토하였다.
문어 간췌장 조효소로부터 쓴맛 개선용 exopeptidase를 효율적으로 분획할 목적으로 ammonium sulfate (AS), polyethylene glycol (PG), anion exchange chromatography (AEC) 및 gel filtration chromatography (GFC) 등으로 분획한 다음 이를 단백질 농도, specific activity (U/mg), total activity (U), 회수율 (Recovery, %) 및 정제도 (fold) 등으로 분획효과를 검토하였다.
분획방법들에 의해 얻어진 endoprotease-, exopeptidase-positive fraction 들의 분획효과를 total activity (U) 및 회수율(%)로 살펴 본 결과 endoprotease-positive fraction에 비해 exopeptidase-positive fraction (EPF)의 활성이 높았다. 각 분획방법들에 의해서 얻어진 최적 획분들간에 exopeptidsae의 활성은 ammonium sulfate fraction (ASF)의 경우 fraction-Ⅳ (ammonium sulfate 포화농도 60-80% 4,050 U, 49.2%), polyethylene glycol fraction (PGF)의 경우 fraction-Ⅳ (20-40% polyethylene glycol; 2,861 U, 34.8%), AEC의 경우 fraction-Ⅰ (fractions no. 7-12; 2,495 U, 30.3%), GFC의 경우 fraction-Ⅰ (fractions no. 32-38; 2,071 U, 25.2%)의 순으로 높았고. 그 중에서 ASF-Ⅳ의 활성이 가장 우수하였다.
문어 간췌장 조효소로부터 쓴맛 개선용 EPF를 효율적으로 이용할 목적으로 문어 간췌장 유래 EPF의 쓴맛 제거제로서 가능성을 casein 가수분해물의 쓴맛 제거 효과에 대하여 관능검사, HPLC profile 등으로 검토하였다. 문어 간췌장 조효소로부터 분획한 ASF-Ⅳ 획분의 쓴맛 개선 효과에 사용할 쓴맛을 나타내는 casein 가수분해물의 제조는 Alcalase로 8시간 동안 반응하는 것이 가장 우수하였다. 관능검사를 통한 ASF-Ⅳ 획분의 쓴맛 개선 효과는 casein 가수분해물에 대하여 1/200으로 첨가한 다음 여러 시간 동안 살펴본 결과 24시간 동안 반응시킨 것이 쓴맛 개선 효과가 나타났으나, 그 정도는 미미하였다. 다음으로 HPLC profile의 area %는 가수분해 시간이 경과함에 따라 상대적으로 친수성이 강한 fraction Ⅰ (peak 1,2)이 증가한 반면, 소수성이 강한 fraction Ⅱ (peak 3-5), Ⅲ (peak 6-10), Ⅳ (peak 11-14)의 경우 감소하였다.
문어 간췌장 조효소로부터 쓴맛 개선용 exopeptidase를 보다 효율적으로 분획 및 이용할 목적으로 AS 처리 후 UF (ultrafiltration) 처리에 의한 2단 분획 (AS-UF)공정을 시도하였고, 이의 쓴맛 개선 효과와 효소 특성에 대하여 검토하였다.
AS-UF 획분은 LeuPNA 기질에 대해 활성, 회수율 및 정제도가 각각 77.3 U/mg, 69.6%, 3.5배이었다. AS-UF 획분의 최적 조건을 검토한 결과 LeuPNA 기질에 대해 pH 및 온도의 경우 각각 7.5 및 40℃이었고, 이들의 안정성은 각각 20-40℃ 및 pH 5-7 영역이었다. 식염 농도에 따른 AS-UF 획분의 분해 활성(LeuPNA)은 농도의 증가와 더불어 감소하였고, 합성 기질에 대한 분해 활성은 AlaPNA, MetPNA, LeuPNA 및 PhePNA의 경우 높았으며 ArgPNA, GluPNA, LysPNA, GlyPNA, ValPNA 및 ProPNA의 경우 낮은 것으로 보아 leucyl aminopepitdase, aminopeptidase M/N 및 aminopeptidase B의 기질 특이성과 유사하였다. 금속이온의 영향은 Cu2+ 이온에 대해 저해를 받은 반면에 Mg2+ 과 Ca2+ 이온에 대해서는 부분적으로 활성을 가져 본 EPF는 leucine aminopeptidase으로 추정되었다. EPF의 Km 정수와 촉매효율(Vmax / Km)은 각각 0.085 mM 및 909.3이었다.
이상의 결과로 미루어 보아 문어 간췌장으로부터 추출한 조효소로부터 분획한 AS-UF 획분(EPF)은 쓴맛 개선능이 인정되었고, 효소특성의 결과로 미루어 보아 leucine aminopeptidase의 특성을 보이는 exopeptidase가 분포하고 있음을 확인하였다. 따라서, EPF는 속성 어간장, 효소 단백 분해물 및 치즈 가공 중에 발생하는 쓴맛을 개선할 수 있는 주요 식품가공 소재로 사용할 수 있을 것으로 판단되었다.
This study examined and compared the exopeptidase and endoprotease activities of the hepatopancreas (HP) of cuttlefish, squid and common octopus species. The protein concentration in crude extracts (CE) from common octopus HP was 3,940 mg/100 g, lower than those in CEs from squid HP (4,157 mg/100 g) and cuttlefish HP (5,940 mg/100 g). With azocasein of pH 6 as a substrate, the specific activity in HP CE of common octopus was 1.9 U/mg, lower than the values for cuttlefish (3.2 U/mg) and squid (5.5 U/mg). Regardless of sample type, the specific activities of the CEs with azocasein as the substrate were higher at pH 6 (1.9-5.5 U/mg) than at pH 9 (1.5-2.0 U/mg). With L-leucine-p-nitroanilide (LeuPNA) of pH 6 as the substrate, the specific activity of the HP CE from common octopus was 11.7 U/mg, higher than values from both cuttlefish HP (4.1 U/mg) and squid HP (5.0 U). Regardless of sample type, the specific activities of the CEs with LeuPNA as the substrate were higher at pH 6 (4.1-11.7 U/mg) than at pH 9 (2.3-10.3 U/mg). With LeuPNA as the substrate, the specific activities of the CEs from common octopus HP and cuttlefish HP were higher at pH 6 than at pH 9. However, there was no difference in specific activity between pH 6 and 9 for squid HP CE with LeuPNA as the substrate.
These results suggested that the common octopus HP is superior to the cuttlefish HP and squid HP as a potential resource for extracting exopeptidase. Exopeptidases from common octopus HP have potential industrial applications and their use might aid in reducing pollution related to the octopus industry.
Conclusion
The aim of this study was to examine the optimum fractionation method and reaction conditions for an endopeptidase- and exopeptidase-positive fraction from crude extracts (CE) of common octopus hepatopancreas (HP) using the following 4 techniques: solid ammonium sulfate fractionation (ASF), polyethylene glycol fractionation (PGF), anion-exchange chromatography (AEC), and gel-filtration chromatography (GFC). Among all fractions obtained by the various fractionation methods, fraction Ⅳ obtained by ammonium sulfate fractionation and polyetylene glycol fractionation, and fraction Ⅰ obtained by anion-exchange chromatography and gel-filtration chromatography showed the highest activity toward LeuPNA. The highest specific and total exopeptidase activity was observed with fraction Ⅳ (36.6 U/mg, 4,050 U) obtained by ammonium sulfate fractionation, followed by fraction Ⅳ (47.6 U/mg, 2,861 U) obtained by polyethlyene glycol fractionation, fraction Ⅰ (33.5 U/mg, 2,495 U) obtained by anion-exchange chromatography, and fraction Ⅰ (40.3 U/mg, 2,071 U) obtained by gel filtration chromatography.
These results suggest that ammonium sulfate fractionation using 60?80% ammonium sulfate is the most efficient method for separating fractions showing exopeptidase activity from CE of common octopus HP.
Conclusion
This study is conducted to investigate debittering effect on bitter casein hydrolysates of exopeptidase-positive fractions from the CE of common octopus hepatopancreas (HP). Alcalase-treated casein hydrolysate was the best bitter-showing substrates for investigating debittering effect of exopeptidase-positive fractions. Debittering on Alcalase-treated casein hydrolysates of the exopeptidase-positive fractions from the CE was improved with elapse of time. After incubating the exopeptidase-positive fractions in Alcalase-treated casein hydrolysates for 24 hrs, bitterness-felt panel member of Alcalase-treated casein hydrolysates was decreased up to three person. Therefore, the exopeptidase-positive fractions from CE of common octopus HP could be used as a substrate for debittering bitter taste in enzymatic protein hydrolysates. The elute of the RP-HPLC was divided into four fractions, among these fractions, fraction Ⅰ (including the peaks 1 and 2), was not bitter, whereas both fraction Ⅱ (peaks 3-5), Ⅲ (peak 6-10) and Ⅳ (peak 11-14) had a bitter taste. As the incubation time processed, the area % increased in fraction Ⅰ (4.8% and 5.2%, respectively, after incubation for 8 hr and 24 hr), while decreased in the other fractions (after incubation for 8 hr and 24 hr, 6.7% and 5.7%, respectively, in fraction Ⅱ, 21.4% and 15.0%, respectively, in fraction Ⅲ, and 10.5% and 9.5%, respectively, in fraction Ⅳ).
The results suggest that the bitterness of casein hydrolysates could be decreased by treating ASF-Ⅳ from the CE of common octopus HP.
Conclusion
This study was conducted to investigate debittering effect of exopeptidase-positive fraction (EPF), which was continuously fractionated by ammonium sulfate fractionation and ultrafiltration (AS-UF), from the crude extracts (CE) of octopus hepatopancreas (HP) on the protein hydrolysates and its enzymatic characterizations. The optimum pH and temperature of the EPF were 40°C and pH 7.0, respectively. The EPF was stable at 20-40°C and pH 5-7, while decreased slightly with increasing concentration of NaCl. The EPF activity toward exopeptidase substrates was the highest in AlaPNA (139%), followed by MetPNA (82.8%) and PhePNA (82.6%), and it was strongly inhibited by Bestatin. The EPF activity was also inhibited by metal ions, such as Cu2+, Hg2+ and Ag+. The apparent Km and Vmax values of EPF toward LeuPNA were 0.085 mM and 77.5 U/mg, respectively.
두족류는 타우린 및 콜라겐 등과 같은 건강 기능성 성분이 풍부하고, 아미노산, 인 및 비타민 등과 같은 영양성분이 다량 함유되어 있으며, 특유의 조직감과 식미를 가지고 있어 오징어의 경우 마른 오징어, 조미 오징어, 오징어 젓갈, 식해 및 냉동식품 등과 같은 소재로, 갑오징어의 경우 전처리하여 여러 가지 요리의 소재로, 그리고 문어의 경우 조미 문어, 자숙 문어 등의 소재로 많이 이용되고 있다. 두족류는 다량 어획되어 여러 가지 가공품으로 제조 시에는 내장, 껍질, 자숙수, 연골 및 갑오징어갑 등과 같은 부산물이 다량 발생하고 있으며, 이들 부산물은 현재 사료와 같이 비효율적으로 이용되고 있거나 전량 폐기되어 환경 오염을 야기하고 있는 실정이다. 하지만, 두족류 부산물인 내장에는 건강 기능성 지질인 EPA와 DHA, 유용 효소 및 단백질이 다량 함유되어 있고, 껍질에는 콜라겐 및 이의 peptide들이 다량 함유되어 있으며, 자숙수에는 유용 맛성분들이, 연골에는 키토산의 소재인 키틴이, 그리고 갑오징어갑에는 유용 무기질인 칼슘이 다량 함유되어 있어 우수한 수산가공 재자원들이다. 따라서 두족류 가공 부산물을 앞에서 언급한 목적의 고부가 소재로 유용 이용할 수 있다면 수산가공자원의 효율적 이용에 의한 자원 문제 해결 측면 뿐만이 아니라 환경 오염원의 근원적 제거라는 사회적 문제도 해결할 수 있어 상당히 의의가 있다고 생각된다.
본 연구에서는 문어 가공 부산물인 간췌장 중 효소 추출 재자원과 같이 효율적 이용을 목적으로 문어 간췌장의 endoprotease 및 exopeptidase의 분포, 여러 가지 분획방법에 따른 특성, 쓴맛 가수분해물의 쓴맛 개선 효과 검토 및 AS-UF 공정에 따른 쓴맛 개선과 효소학적 특성 등에 대하여 검토하였다.
갑오징어, 오징어, 문어 두족류 가공 부산물인 간췌장을 효소제재로 이용하기 위하여 갑오징어, 오징어, 문어 간췌장의 endoprotease와 exopeptidase의 분포 특성에 대하여 살펴본 결과는 다음과 같다. 조효소가 함유되어 있으리라 추정되는 두족류 간췌장의 총 단백질 농도는 갑오징어 간췌장이 5,940 mg/100 g 으로 가장 높았고, 다음으로 오징어 간췌장(4,157 mg/100 g) 및 문어 간췌장(3,940 mg/100 g)의 순이었다.
두족류 간췌장 유래 조효소의 활성을 천연기질(azocasein)과 합성기질 (LeuPNA)로 나누어 살펴 본 결과 3종의 두족류 모두 천연기질의 분해 활성에 비하여 합성기질의 분해 활성이 높아, 두족류 간췌장으로부터 효소를 분리하여 이용하고자 하는 경우 exopeptidase에 초점을 맞추어야 하리라 판단되었다. 또한 exopeptidase를 두족류 간췌장으로부터 추출하고자 하는 경우 문어 간췌장이 갑오징어, 오징어 간췌장 보다 우수하다고 판단되어 이하 실험에서는 문어 간췌장을 이용하여 쓴맛 개선용 exopeptidase의 효율적 분획 방법에 대해 검토하였다.
문어 간췌장 조효소로부터 쓴맛 개선용 exopeptidase를 효율적으로 분획할 목적으로 ammonium sulfate (AS), polyethylene glycol (PG), anion exchange chromatography (AEC) 및 gel filtration chromatography (GFC) 등으로 분획한 다음 이를 단백질 농도, specific activity (U/mg), total activity (U), 회수율 (Recovery, %) 및 정제도 (fold) 등으로 분획효과를 검토하였다.
분획방법들에 의해 얻어진 endoprotease-, exopeptidase-positive fraction 들의 분획효과를 total activity (U) 및 회수율(%)로 살펴 본 결과 endoprotease-positive fraction에 비해 exopeptidase-positive fraction (EPF)의 활성이 높았다. 각 분획방법들에 의해서 얻어진 최적 획분들간에 exopeptidsae의 활성은 ammonium sulfate fraction (ASF)의 경우 fraction-Ⅳ (ammonium sulfate 포화농도 60-80% 4,050 U, 49.2%), polyethylene glycol fraction (PGF)의 경우 fraction-Ⅳ (20-40% polyethylene glycol; 2,861 U, 34.8%), AEC의 경우 fraction-Ⅰ (fractions no. 7-12; 2,495 U, 30.3%), GFC의 경우 fraction-Ⅰ (fractions no. 32-38; 2,071 U, 25.2%)의 순으로 높았고. 그 중에서 ASF-Ⅳ의 활성이 가장 우수하였다.
문어 간췌장 조효소로부터 쓴맛 개선용 EPF를 효율적으로 이용할 목적으로 문어 간췌장 유래 EPF의 쓴맛 제거제로서 가능성을 casein 가수분해물의 쓴맛 제거 효과에 대하여 관능검사, HPLC profile 등으로 검토하였다. 문어 간췌장 조효소로부터 분획한 ASF-Ⅳ 획분의 쓴맛 개선 효과에 사용할 쓴맛을 나타내는 casein 가수분해물의 제조는 Alcalase로 8시간 동안 반응하는 것이 가장 우수하였다. 관능검사를 통한 ASF-Ⅳ 획분의 쓴맛 개선 효과는 casein 가수분해물에 대하여 1/200으로 첨가한 다음 여러 시간 동안 살펴본 결과 24시간 동안 반응시킨 것이 쓴맛 개선 효과가 나타났으나, 그 정도는 미미하였다. 다음으로 HPLC profile의 area %는 가수분해 시간이 경과함에 따라 상대적으로 친수성이 강한 fraction Ⅰ (peak 1,2)이 증가한 반면, 소수성이 강한 fraction Ⅱ (peak 3-5), Ⅲ (peak 6-10), Ⅳ (peak 11-14)의 경우 감소하였다.
문어 간췌장 조효소로부터 쓴맛 개선용 exopeptidase를 보다 효율적으로 분획 및 이용할 목적으로 AS 처리 후 UF (ultrafiltration) 처리에 의한 2단 분획 (AS-UF)공정을 시도하였고, 이의 쓴맛 개선 효과와 효소 특성에 대하여 검토하였다.
AS-UF 획분은 LeuPNA 기질에 대해 활성, 회수율 및 정제도가 각각 77.3 U/mg, 69.6%, 3.5배이었다. AS-UF 획분의 최적 조건을 검토한 결과 LeuPNA 기질에 대해 pH 및 온도의 경우 각각 7.5 및 40℃이었고, 이들의 안정성은 각각 20-40℃ 및 pH 5-7 영역이었다. 식염 농도에 따른 AS-UF 획분의 분해 활성(LeuPNA)은 농도의 증가와 더불어 감소하였고, 합성 기질에 대한 분해 활성은 AlaPNA, MetPNA, LeuPNA 및 PhePNA의 경우 높았으며 ArgPNA, GluPNA, LysPNA, GlyPNA, ValPNA 및 ProPNA의 경우 낮은 것으로 보아 leucyl aminopepitdase, aminopeptidase M/N 및 aminopeptidase B의 기질 특이성과 유사하였다. 금속이온의 영향은 Cu2+ 이온에 대해 저해를 받은 반면에 Mg2+ 과 Ca2+ 이온에 대해서는 부분적으로 활성을 가져 본 EPF는 leucine aminopeptidase으로 추정되었다. EPF의 Km 정수와 촉매효율(Vmax / Km)은 각각 0.085 mM 및 909.3이었다.
이상의 결과로 미루어 보아 문어 간췌장으로부터 추출한 조효소로부터 분획한 AS-UF 획분(EPF)은 쓴맛 개선능이 인정되었고, 효소특성의 결과로 미루어 보아 leucine aminopeptidase의 특성을 보이는 exopeptidase가 분포하고 있음을 확인하였다. 따라서, EPF는 속성 어간장, 효소 단백 분해물 및 치즈 가공 중에 발생하는 쓴맛을 개선할 수 있는 주요 식품가공 소재로 사용할 수 있을 것으로 판단되었다.
This study examined and compared the exopeptidase and endoprotease activities of the hepatopancreas (HP) of cuttlefish, squid and common octopus species. The protein concentration in crude extracts (CE) from common octopus HP was 3,940 mg/100 g, lower than those in CEs from squid HP (4,157 mg/100 g) and cuttlefish HP (5,940 mg/100 g). With azocasein of pH 6 as a substrate, the specific activity in HP CE of common octopus was 1.9 U/mg, lower than the values for cuttlefish (3.2 U/mg) and squid (5.5 U/mg). Regardless of sample type, the specific activities of the CEs with azocasein as the substrate were higher at pH 6 (1.9-5.5 U/mg) than at pH 9 (1.5-2.0 U/mg). With L-leucine-p-nitroanilide (LeuPNA) of pH 6 as the substrate, the specific activity of the HP CE from common octopus was 11.7 U/mg, higher than values from both cuttlefish HP (4.1 U/mg) and squid HP (5.0 U). Regardless of sample type, the specific activities of the CEs with LeuPNA as the substrate were higher at pH 6 (4.1-11.7 U/mg) than at pH 9 (2.3-10.3 U/mg). With LeuPNA as the substrate, the specific activities of the CEs from common octopus HP and cuttlefish HP were higher at pH 6 than at pH 9. However, there was no difference in specific activity between pH 6 and 9 for squid HP CE with LeuPNA as the substrate.
These results suggested that the common octopus HP is superior to the cuttlefish HP and squid HP as a potential resource for extracting exopeptidase. Exopeptidases from common octopus HP have potential industrial applications and their use might aid in reducing pollution related to the octopus industry.
Conclusion
The aim of this study was to examine the optimum fractionation method and reaction conditions for an endopeptidase- and exopeptidase-positive fraction from crude extracts (CE) of common octopus hepatopancreas (HP) using the following 4 techniques: solid ammonium sulfate fractionation (ASF), polyethylene glycol fractionation (PGF), anion-exchange chromatography (AEC), and gel-filtration chromatography (GFC). Among all fractions obtained by the various fractionation methods, fraction Ⅳ obtained by ammonium sulfate fractionation and polyetylene glycol fractionation, and fraction Ⅰ obtained by anion-exchange chromatography and gel-filtration chromatography showed the highest activity toward LeuPNA. The highest specific and total exopeptidase activity was observed with fraction Ⅳ (36.6 U/mg, 4,050 U) obtained by ammonium sulfate fractionation, followed by fraction Ⅳ (47.6 U/mg, 2,861 U) obtained by polyethlyene glycol fractionation, fraction Ⅰ (33.5 U/mg, 2,495 U) obtained by anion-exchange chromatography, and fraction Ⅰ (40.3 U/mg, 2,071 U) obtained by gel filtration chromatography.
These results suggest that ammonium sulfate fractionation using 60?80% ammonium sulfate is the most efficient method for separating fractions showing exopeptidase activity from CE of common octopus HP.
Conclusion
This study is conducted to investigate debittering effect on bitter casein hydrolysates of exopeptidase-positive fractions from the CE of common octopus hepatopancreas (HP). Alcalase-treated casein hydrolysate was the best bitter-showing substrates for investigating debittering effect of exopeptidase-positive fractions. Debittering on Alcalase-treated casein hydrolysates of the exopeptidase-positive fractions from the CE was improved with elapse of time. After incubating the exopeptidase-positive fractions in Alcalase-treated casein hydrolysates for 24 hrs, bitterness-felt panel member of Alcalase-treated casein hydrolysates was decreased up to three person. Therefore, the exopeptidase-positive fractions from CE of common octopus HP could be used as a substrate for debittering bitter taste in enzymatic protein hydrolysates. The elute of the RP-HPLC was divided into four fractions, among these fractions, fraction Ⅰ (including the peaks 1 and 2), was not bitter, whereas both fraction Ⅱ (peaks 3-5), Ⅲ (peak 6-10) and Ⅳ (peak 11-14) had a bitter taste. As the incubation time processed, the area % increased in fraction Ⅰ (4.8% and 5.2%, respectively, after incubation for 8 hr and 24 hr), while decreased in the other fractions (after incubation for 8 hr and 24 hr, 6.7% and 5.7%, respectively, in fraction Ⅱ, 21.4% and 15.0%, respectively, in fraction Ⅲ, and 10.5% and 9.5%, respectively, in fraction Ⅳ).
The results suggest that the bitterness of casein hydrolysates could be decreased by treating ASF-Ⅳ from the CE of common octopus HP.
Conclusion
This study was conducted to investigate debittering effect of exopeptidase-positive fraction (EPF), which was continuously fractionated by ammonium sulfate fractionation and ultrafiltration (AS-UF), from the crude extracts (CE) of octopus hepatopancreas (HP) on the protein hydrolysates and its enzymatic characterizations. The optimum pH and temperature of the EPF were 40°C and pH 7.0, respectively. The EPF was stable at 20-40°C and pH 5-7, while decreased slightly with increasing concentration of NaCl. The EPF activity toward exopeptidase substrates was the highest in AlaPNA (139%), followed by MetPNA (82.8%) and PhePNA (82.6%), and it was strongly inhibited by Bestatin. The EPF activity was also inhibited by metal ions, such as Cu2+, Hg2+ and Ag+. The apparent Km and Vmax values of EPF toward LeuPNA were 0.085 mM and 77.5 U/mg, respectively.
목차
Chapter Ⅰ. Endoprotease and Exopeptidase Activities in the Hepatopancreas of the Cuttlefish (Sepia officinalis L), the Squid (Tadarodes pacificus) and the Common Octopus (Octopus vulgaris Cuvier)Ⅰ. Introduction 1Ⅱ. Materials and Methods 51. Materials 52. Chemicals 53. Proximate composition and Protein concentration 54. Preparation of the crude extracts (CE) 55. Enzyme (endoprotease and exopeptidase) activity 6Ⅲ. Results and Discussion 71. Proximate composition of Neocoleoidea HP 72. Total protein concentration of the CEs 73. Enzyme activities of the CEs 94. Specific activities of the CEs 135. Total activities of the CEs 16Ⅳ. Conclusion 18Chapter Ⅱ. Fractionation of Endoprotease and Exopeptidase from Crude Extracts of Common Octopus Hepatopancreas and Its Enzymatic CharacterizationⅠ. Introduction 19Ⅱ. Materials and Methods 221. Materials 222. Chemicals 223. Preparation of the crude extracts (CE) 224. Protein concentration 235. Activity of endoprotease and exopeptidase 236. Fractionation of endoprotease and exopeptidase 231) Fractionation of the CE by using salts 242) Fractionation of the CE by using polyhydric alcohols 243) Fractionation of the CE on the basis of differences in the ion strength 244) Fractionation of the CE on the basis of differences in the molecular weight 25Ⅲ. Results and Discussion 261. Comparison of endoprotease and exopeptidase activities of CE 262. Optimum fractionation method for obtaining and exopeptidase-positive fraction 273. Exopeptidase activity of fractions by ammonium sulfate fractionation 284. Exopeptidase activity of fractions by polyethylene glycol fractionation 305. Exopeptidase activity of fractions by anion-exchange chromatography 326. Exopeptidase activity of fractions by gel-filtration chromatography 347. Comparison of fractions yielding the highest total exopeptidase activity among all fractions obtained by various fractionation methods 36Ⅳ. Conclusion 39Chapter Ⅲ. Debittering of Bitter-tasting Protein Hydrolysates using Exopeptidase-positive Fractions from the Crude Extracts of Common Octopus (Octopus vulgaris Cuvier) HepatopancreasⅠ. Introduction 40Ⅱ. Materials and Methods 421. Materials 422. Chemicals, enzymes and its substrate 423. Preparation of the crude extracts (CE) 434. Protein concentration 435. Activities of exopeptidase 436. Fractionation of exopeptidase-positive fraction 447. Preparation of bitter enzymatic casein hydrolysates 448. Debittering effect on the casein hydrolysates of exopeptidase-positive fraction 459. Sensory evaluation on the bitterness 4510. Profile analysis of peptide using a HPLC 45Ⅲ. Results and Discussion 471. Screening for casein hydrolysate as a bitter substrate 472. Screening for exopeptidase-positive fraction with debittering effects 483. HPLC profile of bitter casein hydrolysates treated with exopeptidase-positive fraction (fraction Ⅳ obtained from ASF) 49Ⅳ. Conclusion 53Chapter Ⅳ. Debittering Effect of Two-stage Fraction from the Crude Extracts of Common Octopus Hepatopancreas on the Protein Hydrolysates and Its Enzymatic CharacterizationsⅠ. Introduction 54Ⅱ. Materials and Methods 561. Materials 562. Chemicals, enzymes and its substrate 563. Preparation of the crude extracts (CE) 584. Protein concentration 585. Activity of exopeptidase 586. Fractionation of EPF using AS-UF 587. Preparation of enzymatic casein hydrolysates with bitter taste 598. Debittering effect of EPF on the casein hydrolysates 609. Sensory evaluation on the bitter taste 6010. Profile analysis of peptide using a HPLC 6011. Biochemical characterization of the EPF 611) Effect of pH on exopeptidase activity 612) Effect of temperature on exopeptidase activity 623) Effect of the NaCl concentration on the exopeptidase activity 624) Synthetic substrate specificity of the exopeptidase activity 635) Effects of the enzyme inhibitors 636) Effects of metal ions 6412. Kinetic characterization of the EPF 6413. Inhibition constant (Ki) of inhibitors on exopeptidase activity of the EPF 65Ⅲ. Results and Discussion 661. Exopeptidase activity of EPF 662. Effect of EPF on debittering 663. Reverse-phase HPLC profile of EPF-treated casein hydrolysates 684. Biochemical characterization of the EPF 721) Effect of pH on the exopeptidase activity 722) Effect of temperature on the exopeptidase activity 753) Effect of NaCl concentration on the exopeptidase activity 784) Synthetic substrate specificity of the exopeptidase activity 805) Effects of the enzyme inhibitors 826) Effect of metal ions of the exopeptidase activity 845. Kinetic characterization of the EPF 866. Inhibiton constant (Ki) of inhibitors on the exopeptidase activity of the EPF86Ⅳ. Conclusion 89Reference 90
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