Expression of Polyhistidine-Containing Fusion Human HepG2 Type Glucose Transport Protein in Spodoptera Cells and Its Purification Using a Metal Affinity Chromatography

Chong-Kee Lee

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자료유형: 학술저널

저자정보: Chong-Kee Lee (대구가톨릭대학교)

저널정보: 대한의생명과학회 대한의생명과학회지 대한의생명과학회지 제16권 제3호

발행연도: 2010.9

수록면: 201 - 206 (6page)

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In order to develop procedures for the rapid isolation of recombinant sugar transporter in functional form from away from the endogenous insect cell transporter, gene fusion techniques were exploited. Briefly, BamH1-digested human HepG2 type glucose transport protein cDNA was first cloned into a transfer vector pBlueBacHis, containing a tract of six histidine residues. Recombinant baculoviruses including the human cDNA were then generated by allelic exchange following transfection of insect cells with wild-type BaculoGold virus DNA and the recombinant transfer vector. Plaque assay was then performed to obtain and purify recombinant viruses expressing the human transport protein. All the cell samples that had been infected with viruses from the several blue plaques exhibited a positive reaction in the immuassay, demonstrating expression of the glucose transport protein. In contrast, no color development in the immunoassay was observed for cells infected with the wild-type virus or no virus. Immunoblot analysis showed that a major immunoreactive band of apparent Mr 43,000~44,000 was evident in the lysate from cells infected with the recombinant baculovirus. Following expression of the recombinant fusion protein with the metal-binding domain and enterokinase cleavage site, the fusion protein was recovered by competition with imidizole using immobilized metal charged resin. The leader peptide was then removed from the fusion protein by cleavage with porcine enterokinase. Final separation of the recombinant protein of the interest was achieved by passage over Ni²?-charged resin under binding conditions. The expressed transport protein bound cytochalasin B and demonstrated a functional similarity to its human counterpart.

#Baculovirus expression system #Fusion protein #Imidizole purification

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이종기

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