본 연구에서는 황칠나무 추출물을 이용하여 peptide, γ-PGA와 GABA를 강화시킨 발효소재 생산을 목표로 고초균 Bacillus subtilis HA와 젖산균 Lactobacillus plantarum KS2020의 복합발효를 통해 발효소재 생산을 최적화하였다.
황칠나무 추출물은 무기질 성분 분석에서 K의 함량이 457 mg%로 가장 높았고 총 폴리페놀 함량은 49.63 mg GAE/g, 총 플라보노이드 함량은 0.64 mgQE/g으로 나타났다. 1차 고초균 발효의 최적 조건으로 황칠나무 추출물 30%, glucose 2%, MSG 10%를 플라스크에 첨가하여 B. subtilis HA 스타터 5%를 접종한 후 30℃에서 2일간 160 rpm에서 진탕배양을 하였고 1차 고초균 발효물에 skim milk 3%를 추가 투입하여 1일간 42°C, 160 rpm에서 가수분해를 실시하였다.
발효 후 1차 황칠나무 고초균 발효물의 점조도는 3.92 Pa·sn, 점질물 함량은 4.96%의 높은 값을 보였으며, 5 L 발효조에서 1차 황칠나무 고초균 발효물의 점조도는 3.9 Pa·sn, 점질물 함량은 6.44%로 플라스크 배양에 비해 높은 수치를 보였다. 젖산균에 의한 2차 복합발효는 1차 고초균 발효물에 glucose 1.5%, yeast extract 0.5%를 첨가한 뒤 L. plantarum KS2020 스타터를 1% 접종한 후 30℃에서 5일간 정치배양 하였다.
두 조건으로 발효된 황칠 복합 발효물의 단백질 분해 확인을 위해 SDS-PAGE 전기영동을 통해 플라스크 및 5 L 발효조에서의 분해를 확인한 결과 두 조건 모두 skim milk의 casein 단백질이 1일 동안에 가수분해 과정에서 저분자화 되었으며 최종 복합발효 5일 차에는 10 kDa 이하의 분자량으로 감소하였다.
타이로신 함량을 통해 두 조건의 peptide 생성량을 확인하였다. 플라스크에서 5일간 젖산균 복합 발효된 발효물의 타이로신 함량은 208.75 mg%이며, 5 L 발효조를 사용한 발효물은 209.57 mg%로 플라스크 배양보다 5 L 발효조를 통한 배양이 peptide 생성이 유사한 것으로 나타났다. HPLC를 통해 2차 젖산균 복합발효를 통한 최종 발효물의 GABA 정량분석에서 플라스크 배양물은 glutamic acid 0.29 mg/mL, GABA 28.27 mg/mL의 값을 보였으며, 5 L 발효조 배양물은 glutamic acid 0.44 mg/mL, GABA 27.42 mg/mL로 GABA 생성에 있어 유사한 값을 나타내었다.
최종 생리활성물질이 강화된 황칠나무 복합 발효물을 무알코올 맥주 제조에 사용하였다. 황칠나무 복합 발효물 5%, 흑미 1%, 볶은 보리 2%, 맥아 5%, Cascade Hop 0.2%, 흑설탕 2%, 자일리톨 2%, 말토덱스트린 3%, 올리고당 5%, 대추즙 5%를 사용하였다. 알코올 발효 후에 30일 동안 냉장 숙성을 통하여 변화를 비교하였다. pH와 산도는 약 5와 0.04%에서 변화가 없었다. 숙성 기간이 지날수록 알코올은 증가하였으나 20일 차 이후로 2.8%로 유지되었다. 무알코올 맥주의 알코올 규격을 맞추기 위해 황칠나무 복합물을 포함한 비발효 조성물로 희석하였으며, 최종 황칠 무알코올 맥주의 GABA 함량은 약 1.41 mg/mL로 확인되었다.
결론적으로 황칠나무 추출물의 복합발효를 통해서 생성된 기능성 물질 γ-PGA, GABA, peptide와 probiotics가 강화된 복합 기능성 발효 소재를 개발하였으며, 무알코올 맥주 제조를 통해서 다양한 식품소재로 활용이 기대된다.

In this study, aimed to optimize the production of fermented materials by enhancing peptides, γ-PGA, and GABA using extracts from Dendropanax morbiferus extract (DME) through a co-fermentation process involving Bacillus subtilis HA and Lactobacillus plantarum KS2020. The DME showed the highest potassium (K) content of 457 mg%, total polyphenol content of 49.63 mg GAE/g, and total flavonoid content of 0.64 mg QE/g based on the analysis of inorganic components.
For the 1st alkaline fermentation, the optimal conditions involved adding 30% DME, 2% glucose, and 10% MSG to a flask, followed by inoculating 5% B. subtilis HA starter and conducting shake culture at 30°C and 160 rpm for 2 days. Then, skim milk (3%) was added to the 1st alkaline fermented DME broth, and hydrolysis was performed at 42°C, 160 rpm for 1 day. The 1st alkaline fermented DME broth exhibited a high viscosity of 3.92 Pa·sn and a solids content of 4.96%, while the 5 L fermentation showed a viscosity of 3.9 Pa·sn and a solids content of 6.44%, both higher than the flask culture.
For the 2nd co-fermentation by L. plantarum, 1.5% glucose and 0.5% yeast extract were added to the 1st fermented DME broth and 1% L. plantarum KS2020 starter was inoculated, followed by static cultivation at 30°C for 5 days. SDS-PAGE electrophoresis was performed to confirm protein degradation in the fermented samples from both flask and 5 L fermenter, showing that casein protein from skim milk was hydrolyzed into smaller molecules within 1 day and reduced to a molecular weight below 10 kDa by the 5th day of the final co-fermentation. The amount of tyrosine was used to determine the peptide production under both conditions. The tyrosine content in the fermented broth from flask culture by L. plantarum for 5 days was 208.75 mg%, while the 5 L fermentation resulted in 209.57 mg%, indicating a higher peptide production through the 5 L fermenter.
HPLC analysis of the 2nd co-fermented DME broth showed similar values for glutamic acid (0.29 mg/mL) and GABA (28.27 mg/mL) in the flask culture and glutamic acid (0.44 mg/mL) and GABA (27.42 mg/mL) in the 5 L fermenter, indicating comparable GABA production. The enhanced functional ingredient derived from DME was utilized in the production of non-alcoholic beer. The formulation included co-fermented DME 5%, black rice 1%, roasted barley 2%, malt 5%, Cascade Hop 0.2%, brown sugar 2%, xylitol 2%, maltodextrin 3%, oligosaccharide 5%, and jujube juice 5%. Changes in the product were compared during the cold storage from day 0 to day 30. The pH and acidity remained constant at approximately 5 and 0.04%, respectively. Alcohol content increased as the aging period progressed, reaching 2.8% after day 20 and remaining stable thereafter. To meet the alcohol specification of DME non-alcoholic beer, the initial DME mixture without alcohol fermentation was diluted to adjust the alcohol content. The GABA content in the DMD non-alcoholic beer was found to be approximately 1.41 mg/mL.
In conclusion, the co-fermentation of DME resulted in the enhanced production of functional substances such as peptides, γ-PGA, and GABA. These mixed fermented DME can be utilized in the development of various food products, including not only beer but also other food ingredients.