본 연구에서는 황칠나무 열수추출물(Dendropanax morbiferus extract, DME)을 이용하여 peptide와 GABA 및 probiotics를 강화한 발효소재 생산을 위해서 고초균 Bacillus subtilis HA와 젖산균 Lactobacillus plantarum KS2020의 혼합발효를 최적화하였다. DME는 고형분 함량 7.2%, pH 5.80과 산도 0.02%, 환원당 함량 1.08 mg/g이었으며, 폴리페놀 함량은 49.63 mg GAE/g, 총 플라보노이드 함량은 0.64 mg QE/g으로 확인되었다. 무기질 분석에서는 K가 4,576.04 μg/mL로 가장 높았다. 1차 고초균 발효의 최적 조건은 DME 10%에 glucose 2%, skim milk 1%를 첨가하여 B. subtilis HA starter 5%를 접종한 후 37℃에서 15시간 동안 160 rpm에서 플라스크 진탕배양을 하였다. Protease activity는 약 450 unit/mL로 높은 단백질 분해 활성을 보였다. 1차 고초균 발효물에 가쓰오부시 10%를 추가로 투입하여 3시간 동안 60℃, 120 rpm에서 단백질 가수분해 한 tyrosine 함량이 1.66 mg/mL로 나타났다. 2차 혼합발효에서는 가쓰오부시 단백질 가수분해물에 glucose 3%, MSG 10%, yeast extract 0.5%를 첨가한 뒤 L. plantarum KS2020 starter를 1% 접종한 후 30℃에서 3일간 정치배양 하고, glucose 1%를 추가로 더 첨가한 뒤 4일간 정치배양 하였다. 2차 혼합발효 7일 차에 HPLC를 통한 발효물의 GABA 정량 분석에서 glutamic acid는 1.02 mg/mL, GABA는 54.67 mg/mL로 확인되었다. SDS-PAGE 전기영동을 통해 skim milk의 casein 단백질이 15시간 동안에 저분자화 된 것으로 나타났으며 가쓰오부시의 고분자 단백질이 3시간 만에 저분자로 분해된 것을 확인하였다. 항산화 활성을 측정한 결과 DME의 DPPH RC50 값은 388.31 μg/mL, ABTS RC50 값은 211.39 μg/mL였고 가쓰오부시 단백질 가수분해물의 DPPH RC50 값은 203.42 μg/mL, ABTS RC50 값은 96.43 μg/mL, 가쓰오부시 혼합발효물의 DPPH RC50 값은 1,365.00 μg/mL, ABTS RC50 값은 1,711.03 μg/mL로 나타났다. 가쓰오부시 발효물을 시판 쯔유에 농도별로 첨가하여 실온에서 4주간 관찰한 결과 3주 차에 모든 생균이 사멸하여 품질이나 외관상의 문제가 없는 것으로 확인되었다. 결론적으로 DME와 가쓰오부시의 고초균과 젖산균 혼합발효를 통해서 peptide와 GABA 및 probiotics가 강화된 기능성 발효소재 개발을 통해서 다양한 고부가가치 제품개발에 적용할 수 있는 기능성 발효소재로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
In this study, the co-fermentation of the probiotic strains Bacillus subtilis HA and Lactobacillus plantarum KS2020 was optimized to produce a multi-functional material enhanced with peptides and GABA using Dendropanax morbiferus extract (DME). The DME had a solid content of 7.2%, pH 5.80, acidity of 0.02%, and a reducing sugar content of 1.08 mg/g. The polyphenol content was measured to be 49.63 mg GAE/g, while the total flavonoid content was found to be 0.64 mg QE/g. In terms of mineral analysis, potassium (K) exhibited the highest concentration at 4,576.04 μg/mL. To optimize the conditions for the 1st alkaline fermentation, 2% glucose and 1% skim milk were added to the DME to inoculate 5% B. subtilis HA starter, followed by shake-culture at 160 rpm in a flask (37°C for 15 hours). The protease activity exhibited approximately 450 unit/mL. In the 1st fermented product an additional 10% katsuobushi was added for protein hydrolysis. The hydrolysis process was conducted at 60℃ and 120 rpm for 3 hours. The resulting hydrolysate of katsuobushi protein showed a tyrosine content of 1.66 mg/mL. In the co-fermentation by lactic acid bacteria, 3% glucose and 10% MSG were added to the hydrolyzed katsuobushi product. L. plantarum KS2020 starter were inoculated at 1% each, and cultured at 30℃ for 7 days. In addition, on the third day of lactic acid fermentation, an additional 1% glucose was added. On the 7th day of the co-fermentation, quantitative analysis of GABA in the fermented product was performed using HPLC. The results showed a glutamic acid content of 1.02 mg/mL and a GABA content of 54.67 mg/mL. Through SDS-PAGE electrophoresis, it was confirmed that the casein protein of skim milk became low molecular weight in 15 hours and the high molecular weight protein of katsuobushi became low molecular weight in 3 hours. The DPPH RC50 value of DME was measured to be 388.31 μg/mL, and the ABTS RC50 value was 211.39 μg/mL. The DPPH RC50 value of katsuobushi proteolyzate was 203.42 μg/mL, and the ABTS RC50 value was 96.43 μg/mL. The DPPH RC50 value of co-fermented katsuobushi protein was 1,365.00 μg/mL, and the ABTS RC50 value was 1,711.03 μg/mL. The co-fermented katsuobushi protein was added to commercially available soy sauce at various concentrations and observed at room temperature for 4 weeks. It was confirmed that by the 3rd week, all viable bacteria had been eliminated in soy sauce mixed with co-fermented katsuobushi. In conclusion, it is expected that the co-fermentation of DME and katsuobushi can lead to the development of functional fermented ingredients enriched with peptides, GABA, and probiotics. These functional fermented ingredients have the potential to be utilized in various value-added product developments in the food industry.
Ⅰ. 서론 1Ⅱ. 재료 및 방법 41. 재료 42. 사용 균주 및 starter 제조 43. DME의 일반 성분 분석 61) 수분 및 고형분 함량 측정 62) DNS법에 따른 glucose 환원당 함량 측정 63) 총 폴리페놀 함량 분석 64) 총 플라보노이드 함량 분석 75) 무기질 분석 74. 혼합 균주 발효에 의한 protease 및 peptide, GABA 생산 101) DME의 고초균 발효 및 가쓰오부시 단백질 분해 10(1) 가쓰오부시의 전처리 10(2) DME의 고초균 발효 10(3) 가쓰오부시 단백질의 분해 102) 가쓰오부시 단백질 가수분해물의 젖산균 혼합발효 135. 가쓰오부시 발효물을 첨가한 쯔유 제조 136. 혼합발효물의 이화학적 분석 151) 생균수 측정 152) pH 및 산도 측정 153) Protease activity 측정 154) Peptide 함량 측정 165) SDS-PAGE 분석 166) HPLC를 이용한 유리당 함량 측정 177) GABA 및 glutamic acid의 정성 및 정량 분석 19(1) Thin layer chromatography (TLC)를 이용한 정성 분석 19(2) HPLC를 이용한 정량 분석 197. 단백질 가수분해물과 혼합발효물의 항산화 평가 241) DPPH radical 소거활성 측정 242) ABTS radical 소거활성 측정 248. 통계처리 25Ⅲ. 결과 및 고찰 261. DME의 이화학적 분석 및 무기질 함량 261) DME의 이화학적 분석 262) DME의 무기질 함량 282. 가쓰오부시 단백질의 이화학적 분석 303. DME의 고초균 발효조건의 최적화 321) Skim milk의 농도에 따른 고초균 발효 특성 32(1) 발효물의 protease activity 32(2) 생균수 차이 34(3) Peptide 생성 차이 342) 온도와 시간에 따른 고초균 발효 특성 37(1) Protease activity 변화 37(2) 고초균의 생균수 변화 39(3) Peptide 함량 변화 393) DME의 농도에 따른 고초균 발효 특성 42(1) DME의 protease activity 42(2) 생균수 차이 424) 한방 소재 별 고초균 발효 특성 45(1) 한방소재 추출물의 고초균 발효물 protease activity 45(2) 한방소재 추출물에 따른 고초균 생균수 454. 가쓰오부시의 단백질 분해 최적화 481) Flavourzyme 농도에 따른 peptide 생산 482) 기질에 따른 peptide 생산 503) 온도에 따른 peptide 생산량 차이 524) 가쓰오부시의 단백질 가수분해물의 정성 분석 545. 가쓰오부시 단백질 가수분해물의 젖산균 혼합발효 561) Glucose 농도에 따른 혼합발효 특성 56(1) 고초균 젖산균의 혼합발효 중 생균수 변화 56(2) 고초균 젖산균 혼합발효 중 pH 및 산도 변화 58(3) 혼합발효물의 GABA 정성 분석 602) 온도에 따른 혼합발효 특성 62(1) 고초균 젖산균의 혼합발효 중 생균수 변화 62(2) 고초균 젖산균 혼합발효 중 pH 및 산도 변화 64(3) 혼합발효물의 GABA 정성분석 66(4) 혼합발효물의 GABA 정량 분석 66(5) 고초균 젖산균 혼합발효 중의 유리당 변화 696. 단백질 가수분해물과 혼합발효물의 항산화 평가 711) DPPH radical 소거활성 측정 712) ABTS radical 소거활성 측정 737. 가쓰오부시 발효물을 첨가한 쯔유의 저장 중 특성 751) 젖산균의 생균수 변화 752) pH 및 산도 변화 752) GABA와 glutamic acid의 함량 정량 분석 75Ⅳ. 결론 81Ⅴ. 참고 문헌 83(영문초록) 90(국문초록) 93