Enterococci는 사람과 동물의 장관 내에 존재하는 정상 세균 군 무리의 일종으로 자연 환경에도 널리 분포되어 있고 젖산을 생성하는 유산균으로서 발효식품과 프로바이오틱스 제품으로 널리 사용되고 있다. 그러나 이 균은 면역성이 약한 만성 질환자에게 수술 후 원내 감염, 비뇨기 감염 및 균혈증 등을 발생시킬 수 있는 주요 원인균이면서 vancomycin을 비롯한 다양한 항생제에 내성을 가진 다재내성균으로도 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 신규로 분리한 E. faecium CKDB003 균주에 대해 안전성을 평가할 목적으로 식품의약품안전처가 제안하고 의무화한 항생제내성 및 병독성 유전자 평가를 수행하였다. E. faecium CKDB003 균주에 대한 항생제 최소억제농도검사(MIC test)를 수행한 결과, EFSA 가이던스에 규정된 10종의 항생제들에 대해 최대 허용 수준인 MIC cut-off value의 이하로 확인되었다. 그리고 항생제 내성 및 병독성 유전자를 확인하기 위한 전장 유전체 분석 결과, 항생제들 중 aminoglycoside 계열 항생제 내성 유전자인 aac(6’)-li과 macrolide 계열 항생제 내성 유전자인 eatAv, msr(C)가 존재하는 것이 확인되었으나 이는 chromosome 내에 존재하고 plasmid에는 존재하지 않아 전이 가능성이 없는 것으로 확인되었다. 추가로 병독성 인자들의 유전자인 cytolysin(cylA, cylB, cylI, cylL-l, cylL-s, cylM, cylR1, cylR2), aggregation substance(asa1, asp1), collagen adhesion(ace), enterococcal surface protein(esp), endocarditis antigen (efaA), hyaluronidase(hyl) 및 gelatinase(gelE)가 부재함을 확인하였다. 또한 독성효소 활성에 대해 생화학적 분석을 수행한 결과 모두 활성이 없는 것으로 나타났으며, PCR 방법에 의해서도 병독성 인자들인 cytolysin, aggregation substance, hyaluronidase, gelatinase 유전자들이 검출되지 않았다. 마지막으로 E. faecium CKDB003 균주를 배양한 후 얻은 건조 분말을 사용하여 단회 경구투여 독성 시험한 결과에서도 특이한 증상을 발견할 수 없어 E. faecium CKDB003 균주가 안전함을 확인할 수 있었다.
안전성이 확보된 E. faecium CKDB003 균주를 사용하여 프로바이오틱스 원말 제품을 상업적 생산규모로 생산하기 위해서 최초로 생산되는 연속 3 batch에 대해 process validation을 실시하였다. 그 결과 설정된 parameter들의 결과 값은 모두 설정된 기준 이내에 적합하였으며 유산균수는 평균 5.7x1011 CFU/g로 나타나 모든 제조공정이 균질성 있고 재현성 있게 생산될 수 있다는 것을 검증하였다. 또한 이 과정에서 사용되는 시험방법도 validation을 통해 평가하여 시험방법을 확립하였다. 그리고 생산된 프로바이오틱스 E. faecium 원말에 대하여 안정성 시험을 실시하여 유효기간 3년 이상의 안정적인 보관 기간과 보관 방법을 확립하였다.
요약하면 E. faecium CKDB003 균주는 항생제 최소억제농도 검사, 전장 유전체 분석, 생화학적 시험에 의한 활성 확인 및 단회투여 독성시험 결과를 근거로 건강기능식품 프로바이오틱스로서 안전하게 사용 가능한 것으로 결론지을 수 있다. 그리고 validation된 시험방법으로 제조공정의 process validation과 생산 제품의 안정성시험 등을 통해 생산 공정의 균질성과 재현성이 검증되었다. 이러한 연구결과는 프로바이오틱스 균주들의 안전성 평가관련 허가 등록 자료로 이용이 가능하며 프로바이오틱스의 대량 상업적 생산 시 공정 타당성을 검증하는데 바람직한 접근 모델을 제시하였다.