돼지써코바이러스 2형(porcine circovirus type 2, PCV2)은 Circoviridae과 Circovirus속으로 분류되며, envelope가 없고, 바이러스 직경은 17 nm로 동물 바이러스 중 가장 작으며, 약 1.7 kb의 circular single-stranded DNA를 가지고 있다. PCV2는 이유후전신소모성증후군 (postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)를 포함한 돼지써코바이러스 관련질병 (PCV-associated disease, PCVAD)의 원인체이며, 전세계의 양돈산업에서 상당한 경제적 손실을 주고 있다. PCV2 캡시드 (capsid, CP) 단백질은 ORF2에 의해 암호화되어 있으며, 주요 구조적 단백질로 PCV2-특이적인 중화항체를 유도하기 때문에 백신개발에 있어 중요한 방어항원으로 알려져 있다. 그러나, 대부분의 상업용 PCV2 백신은 PCV2a 유전형의 capsid를 기반으로 제작되었기 때문에 현재 유행하고 있는 PCV2d를 완전하게 예방할 수 없다. 그러므로 본 연구에서는 PCV2 ORF2의 유전적 특성을 분석하였고, 돼지에서 새로운 재조합 PCV2d 백신에 대한 면역원성을 평가하였다.
PCV2 ORF2의 유전자를 분석하기 위해, 2016년부터 2017년도 사이에 국내 23개 농장에서 244개의 혈액 또는 타액 시료를 무작위로 채취하여 바이러스 DNA를 추출하였다. 그 결과 계통분류학적 분석을 통해 각각 PCV2a 2주 (11.8%), PCV2b 2주 (11.8%) 그리고 PCV2d 13주 (76.4%)의 유전형이 확인되었다. PCV2 17주 사이의 ORF2 염기서열은 88.3% - 100%, 아미노산서열은 86.3% - 100% 일치하였다. 본 연구를 통해 국내에서는 PCV2a, PCV2b 그리고 PCV2d가 함께 유행하고 있으며, 그 중 PCV2d가 가장 우세한 유전형으로 나타났다. 또한 PCV2 분리주는 다양한 항체 인식 도메인을 가진 capsid 단백질을 계속해서 변화하고 있다는 사실을 알 수 있었다.
PCV2 capsid 단백질의 디코이 에피토프 (decoy epitope) (capsid 169-STIDYFQPNNKR-180)는 숙주 면역반응에서 방어항체가 결합하는 에피토프를 회피하는 전략으로 보고되어 왔다. 그러나 디코이 에피토프는 PCV2에 대해 방어적인 일차원적 또는 삼차원적 에피토프가 포함되어 있을 수 있다. 따라서, 본 연구에서는 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 capsid (1-233)와 디코이 에피토프가 삭제된 mutant capsid (Δ169-180) 단백질을 발현하였고, 마우스에서의 면역반응을 평가하였다. 그 결과 mutant capsid (Δ169-180) 단백질은 바이러스 유사입자 (virus-like particle, VLP)를 효과적으로 형성하지 못하였고, 마우스에서 상당히 낮은 수준의 PCV2 capsid-특이적인 IgG 항체가와 바이러스 중화항체를 유도하였다. 따라서, 디코이 에피톱은 캡시드의 안정된 VLP 형성과 방어적 면역반응의 향상을 위해 매우 중요하다고 할 수 있다.
PCV2d 유전형이 출현함에 따라 PCVAD 발생과의 연관성이 보고되어 왔다. 그러나, PCV2a 기반의 상업용 백신은 PCV2d 감염에 완전한 방어를 기대할 수 없다. 본 연구에서는 PCV2b와 PCV2d 기반의 캡시드 단백질을 베큘로바이러스 발현 시스템을 통해 제작하였으며, 정제된 재조합 단백질은 성공적으로 자가조립되어 VLP가 형성된 것을 확인하였다. 자연적으로 PCV2d에 감염된 돼지에서 방어 면역반응을 평가하기 위해 모체이행항체를 보유한 3주령의 돼지에 정제된 Bac-2dCP, Bac-mCP (정제된 Bac-2bCP와 Bac-2dCP의 혼합), PCV2a 기반의 상용백신 그리고 생리식염수 (대조군)를 각각 접종하였다. 그 결과 Bac-2dCP와 Bac-mCP 접종그룹은 PCV2d에 자연적으로 감염된 돼지에서 접종 후 42일까지 높은 수준의 PCV2b- 또는 PCV2d-특이적인 IgG 항체가를 유지하였다. 그러나, 대조군은 접종 후 28일과 42일 사이에서 IgG 항체가가 상당히 감소하였다. 흥미롭게도 Bac-2dCP 그룹은 대조군에 비해 PCV2d의 바이러스 혈증이 상당히 감소하였으며 (P<0.01), 높은 중화항체가를 나타냈다. 따라서, 재조합 Bac-2dCP 단백질은 PCVAD 발생과 연관된 최근 유행하고 있는 PCV2d의 감염과 전염을 효과적으로 예방할 수 있는 잠재적 백신 후보로 적합한 것으로 나타났다.

Porcine circovirus (PCV) is the smallest known animal virus, a nonenveloped, circular single-stranded DNA (1.7 kb) virus with diameter of 17 nm belonging to the genus Circovirus in the family Circoviridae. The pathogenic PCV2 is the primary causative agent of PCV-associated diseases (PCVAD), including postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), which causes major economic losses in the swine industry worldwide. PCV2 capsid protein encoded by open reading frame (ORF) 2 is a major structure protein containing PCV2-specific neutralizing epitopes and is important protective antigen for vaccine development to control PCV2. However, most commercial PCV2 vaccines were designed based on the PCV2a capsid protein, which does not assure complete prevention of currently predominant PCV2d genotype. Therefore, present study analyzed the genetic characterization of PCV2 ORF2 and evaluated the immunogenicity of novel recombinant PCV2d vaccine in pigs.
To investigate the heterogeneity in the ORF2 gene of the PCV2 isolates, the blood and saliva samples were randomly selected from pig farms in Korea from 2016 to 2017 and viral DNA was extracted. The results showed that 2 (11.8%), 2 (11.8%), and 13 (76.4%) were determined as PCV2a, PCV2b, and PCV2d genotypes, respectively. The degree of identity of ORF2 from the 17 PCV2 isolates ranged from 88.3% to 100% (86.3% to 100%) at the nucleotide (deduced amino acid) level. This study revealed that PCV2d is currently the predominant genotype in the Korean pig population, and all PCV2 isolates are continually changing their capsid protein including multiple antibody recognition domains.
The PCV2 capsid residues 169-STIDYFQPNNKR-180 have been identified as a decoy epitope that diverts the host immune response away from protective epitopes. However, the decoy epitope may include important linear or conformational protective epitopes against PCV2. This study used the baculovirus system to express recombinant complete capsid (1-233) and mutant capsid (Δ169-180), in which the decoy epitope was deleted, and evaluated the immune response to these in mice. The mutant capsid (Δ169-180) protein did not induces efficient virus-like particles (VLPs) formation, significantly lower levels of PCV2 capsid-specific IgG antibodies, and a slightly lower neutralizing activity than with immunization with complete capsid (1-233) protein. This finding suggests that the complete PCV2 capsid protein is important for stable VLP formation and to improve the protective immune response.
Emergence of the PCV2d genotype has been linked with PCVAD outbreaks. However, the PCV2a-based commercial vaccines do not ensure complete protection against PCV2d infection and transmission. In this study, PCV2b- and PCV2d-based capsid proteins derived from a baculovirus expression system were expressed, and the purified recombinant proteins successfully self-assembled into virus-like particles. To evaluate the protective immune response in pigs naturally infected with PCV2d, 3-week-old pigs with maternal antibodies were immunized with purified Bac-2dCP, Bac-mCP (mixed with purified Bac-2bCP and Bac-2dCP), a commercial PCV2a-based vaccine or phosphate-buffered saline (PBS) as controls. The Bac-2dCP and Bac-mCP groups induced high levels of PCV2b- or PCV2d-specific IgG antibodies in pigs naturally infected with PCV2d. However, the IgG levels in the control group declined significantly. Interestingly, PCV2d viremia levels were significantly reduced in the Bac-2dCP group than the control group and highly PCV2b-specific neutralizing antibodies were also detected. Therefore, the recombinant Bac-2dCP protein is a good candidate for control of PCV2d infection and transmission and for preventing PCVAD outbreaks.