조골세포(Osteoblast)는 중간엽 줄기 세포(Mesenchymal stem cells; MSCs)로부터 시작하며, 조골세포 분화(Osteoblast differentiation) 과정은 증식(Proliferation), 성숙(Maturation), 무기질화(Mineralization)로 나누어진다. Cell proliferation 단계에서는 Transforming growth factor-β (TGF-β), Fibronectin, Bone morphogenetic protein 2 (BMP2)등에 의해 조절되며, Inhibitor of DNA binding 1 (ID-1), Distal-less homeobox 5 (Dlx5), Runt-related transcription factor 2 (Runx2)와 같은 유전자의 발현이 증가 된다. Maturation 단계에서는 Alkaline phosphatase (ALP)의 발현이 극대화되는 시기이고, osteocalcin (OC)의 유전자의 발현 또한 증가 된다. 마지막으로, cell mineralization에서는 OC, Bone sialoprotein, Osteopontin 등의 유전자 발현이 증가한다.
BMP2는 골 분화 유도 단백질로 생체 내외(In vitro, In vivo)에서 osteoblast differentiation을 촉진한다. BMP2 신호전달은 세포 내 단백질인 Smad의 인산화(Phosphorylation)를 유도함으로써 osetoblast differentiation 표지 유전자들이 자극된다. 이전보고에 따르면, BMP2는 mild Endoplasmic reticulum (ER) stress를 유도함으로써 osteoblast differentiation이 증가 된다. ER stress는 3개의 단백질 센서에 의해서 세포 내 신호전달을 한다. 단백질 센서에는 activating transcription factor 6 (ATF6), inositol-requiring kinase 1 (IRE1), pancreatic ER eukaryotic translation initiation factor 2 (eIF2a) kinase (PERK)가 있으며, 각각 다른 신호전달 기전을 작동시킨다. ER stress는 세포의 생사를 조절하는 스위치로 알려져 있다.
Kisspeptin은 사춘기 조절 유전자이며, 종양 전이 억제 단백질로 보고되었다. 또한, Kisspeptin은 Kiss1 유전자에서 생성되는 단백질로 세포막에 존재하는 G-protein coupled receptor 54 (GPR54)를 통하여 세포 내 신호전달을 하게 된다. Kisspeptin 10은 NFAT의 활성을 조절하여 신장 발달에 중요하게 작용하며, NFAT은 또한 BMP의 발현을 증가시킨다고 알려져 있다. 하지만, 아직 osteoblast differentiation 동안에 Kisspeptin의 역할이 보고된 바 없다. 본 논문에서 Kisspeptin 10의 처리에 의해서 osteoblast differentiation 표지 유전자들 및 BMP2의 발현이 시간 및 농도 의존적으로 증가함을 확인하였고, Kisspeptin 10 처리에 의해서 Smad 1/5/9 phosphorylation 또한 증가 되었다. 본 연구에서 Kisspeptin10 처리로 BMP2 발현을 증가시키는 조절 인자를 확인하기 위해 NFATs의 발현을 확인하였고, NFATc4의 발현이 현저하게 증가함을 PCR 분석을 통하여 확인하였다. 다음으로 NFATc4 과발현에 의해 BMP2의 발현 및 osteoblast differentiation가 증가되지만, siNFATc4에 의해서는 osteoblast differentiation가 감소하였다. 마지막으로, GRP54 knock out 세포를 구축하여 osteoblast differentiation에서도 Kisspeptin 10이 GPR54를 통하여 세포 내 신호전달을 하고 있음을 확인하였다. 또한, Kisspeptin 10에 의해 증가된 BMP2가 세포 밖으로 자가 분비됨을 확인하였다. 위의 연구 결과들을 정리하면, Kisspeptin 10/GPR54는 osteoblast differentiation를 증가시키고, NFATc4를 조절하여 BMP2의 발현을 유도하고, BMP2는 세포 밖으로 자가 분비가 되어 다음 신호전달인 Smad 1/5/9 phosphorylation을 유도한다.
Curcumin은 강황의 뿌리 및 줄기에 존재하는 폴리페놀 화합물로 알려져 있으며, anti-inflammation, anti-cancer, anti-oxidant 작용을 하고 있다고 알려져 있다. 뿐 만 아니라, Curcumin은 암세포에서 Endoplasmic Reticulum Stress (ER stress)를 유도하여 apoptosis에 이르게 한다고도 보고되었다. 하지만 아직까지 curcumin이 osteoblast differentiation에서 어떠한 기전을 통하는지 보고된 바 없다. 본 연구에서 curcumin 처리에 의해 osteoblast differentiation가 증가하며, curcumin 처리에 의해서 mild ER stress의 표지 유전자들인 Binding immunoglobulin protein (BiP), CHOP, EDEM, ATF4의 발현이 증가함을 확인하였다. 게다가, curcumin은 ATF6-luc activity를 증가시키고, CREBH-luc activity를 감소시킴으로써 BMP2와 유사하게 osteoblast differentiation를 증가시킴을 확인하였다. 다음은 curcumin과 구조적 유사체인 curculactone A와 curculactone B 또한 osteoblast differentiation에서 긍정적인 역할을 하고 있음을 확인하였다. 따라서 curcumin, curculactone A와 curculactone B는 osteoblast differentiation을 유도하며, 그 중 curcumin은 Runx2의 발현을 통하여 osteoblast differentiation을 조절하며, BMP2와 유사하게 mild ER stress를 유도하여 ATF6 의 발현을 증가 시켰다.
Fat mass and obesity associated (FTO)는 비만 유전자로 알려져 있으며, FTO의 돌연변이는 비만과 당뇨병을 유도한다고 보고되어져 있다. 간세포에서는 FTO의 발현이 증가하면 지질 침작을 유도하여 oxidative stress를 유도하고, FTO는 AMPK와 상호 관련성이 보고된 바 있다. 본 연구의 결과에 따르면, BMP2 처리에 osteoblast differentiation이 진행되는 동안 FTO의 발현이 증가하고, FTO 과발현에 의해서 osteoblast differentiation 표지 유전자가 증가하지만 siFTO에 의해서 osteoblast differentiation이 감소하였다. Osteoblast에서 FTO와 AMPK는 positive feedback을 하고 있음을 PCR과 western blot 분석으로 통하여 확인하였다. 뿐 만 아니라, AMPK와 FTO 모두 mild ER stress를 유도하여 osteoblast differentiation를 유도하였다. 하지만, ER stress를 강력하게 유도한다고 알려진 tunicamycin을 처리하였을 때, AMPK 및 FTO의 발현을 감소시켰다. 따라서, osteoblast differentiation에서 FTO는 AMPK와 positive feedback을 하고 mild ER stress를 통하여 osteoblast differentiation의 증가를 입증하였다.
본 논문의 내용을 종합하자면, osteoblast differentiation에 있어서 mild ER stress 유도 물질 및 유전자는 cell differentiation에 긍정적인 역할을 하고 있음을 제시한다.

Osteoblast differentiation is highly regulated by a range of hormones, cytokines, and multiple transcription factors. Osteoblasts express various phenotypic markers, such as BMPs, Distal-less homeobox 5 (Dlx5), Runt-related transcription factor 2 (Runx2), alkaline phosphatase (ALP), and osteocalcin (OC). Among BMPs, BMP2 is the most effective inducer of osteoblast differentiation. In addition, BMP2 regulates the early stage of osteoblast differentiation such as ID1, Dlx5, and Runx2 via activating Smad 1/5/9. These factors also stimulate the expression of marker genes of the next stage of osteogenesis, including ALP and OC. Osteogenesis is stimulated by BMP2 through pathways activated by mild endoplasmic reticulum (ER) stress involving major UPR inducers, such as protein kinase R (PKR)-like ER kinase (PERK), inositol-requiring enzyme 1 (IRE1), and activating transcription factor 6 (ATF6).
The cytotoxicity of curcumin, curculactone A, or curculactone B was identified using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Expression of osteogenic markers, FTO, and ER stress markers in C3H10T1/2 cells were measured using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time PCR and Western blotting. ALP staining was performed to assess ALP activity. And Alizarin red S staining was performed to examine extracellular minera.ization. Transcriptional activity was detected using a luciferase reporter assay.
Kisspeptin10 acts as a tumor metastasis suppressor via its receptor, G protein-coupled receptor (GPR) 54. The Kisspeptin10/GPR54 system plays an important role in embryonic Kidney development. However, It functions in osteoblast differentiation are unknown. Osteoblast differentiation is controlled by a range of hormones and cytokines, such as BMPs, and multiple transcription factors, such as Runx2, ALP, and Dlx5. In the present study, Kisspeptin10 treatment significantly increased the expression of osteogenic genes, including mRNA and protein levels of BMP2, in C3H10T1/2 cells. Moreover, Kisspeptin 10 induced BMP2-luc activity and increased phosphorylation of Smad1/5/9. In addition, NFATc4 specifically mediated Kisspeptin10-induced BMP2 gene expression. However, Kisspeptin10 treatment didn’t induce expression of the BMP2 and Runx2 genes in GPR54 Knock out cells. To examine whether Kisspeptin10 induced secretion of BMP2 to the culture medium, we used the conditioned medium (C.M) of Kisspeptin10 treated medium on C3H10T1/2 cells. Dlx5 and Runx2 expression were higher in GPR54 Knock out cells treated with C.M than in those treated with Kisspeptin10. These results demonstrate that BMP2 protein has an autocrine effect, upon Kisspeptin10 treatment. Taken together, these findings suggest that Kisspeptin10/GPR54 signaling induces osteoblast differentiation via NFATc4-mediated BMP2 expression.
Curcumin (Diferuloylmethane or [1E, 6E]-1,7-bis[4-hydroxy-3-methoxyphenyl]-1,6 heptadiene-3,5-dione) is a phenolic natural product derived from the rhizomes of the turmeric plant, Curcuma longa. It’s reported to have various biological actions such as anti-oxidative, anti-inflammatory, and anti-cancer effects. However, the molecular mechanism of osteoblast differentiation by curcumin has not yet been reported. Curcumin increased the expression of genes such as Dlx5, Runx2, ALP, and OC, which subsequently induced osteoblast differentiation in C3H10T1/2 cells. In addition, ALP activity and mineralization was found to be increased by curcumin treatment. Curcumin also induced mild ER stress similar to BMP2 function in osteoblast cells. Next, we confirmed that curcumin increased mild ER stress and osteoblast differentiation similar to BMP2 in C3H10T1/2 cells. Transient transfection studies also showed that curcumin increased ATF6-luc activity while decreasing the activities of CREBH-luc and SMILE-luc. In addition, similar to BMP2, curcumin induced the phosphorylation of Smad 1/5/9.
Curculactone A and curculactone B are rare γ-lactone derivatives obtained from yellow, natural curcumin following irradiation, and are a type of small molecules with a moderate anti-obesity effect. However, the exact role of curculactone A or curculactone B in osteoblast differentiation is unknown. In this study, the effects of curculactone A or curculactone B on the differentiation of the osteogenic cells were examined. Curculactone A or curculactone B could markedly increase the mRNA levels of osteogenic marker genes and ALP activity. Collectively, our findings indicate that curculactone A or curculactone B induced osteoblast differentiation through the osteogenic expression of genes such as Dlx5, Runx2, ALP, and OC. Overall these results demonstrate that curcumin-induced mild ER stress increases osteoblast differentiation via ATF6 expression in C3H10T1/2 cells. And curculactone A or curculactone B induced osteoblast differentiation.
Fat mass and obesity-associated (FTO) gene helps to regulate energy homeostasis in mammals by controlling energy expenditure. In addition, FTO functions in the regulation of obesity and adipogenic differentiation, however, a role in osteogenic differentiation is unknown. This study investigated the effects of FTO on osteogenic differentiation of C3H10T1/2 cells and the underlying mechanism. The expression of osteogenic and ER stress markers was characterized by RT-PCR and western blotting. ALP staining was performed to assess ALP activity. BMP2 treatment increased mRNA expression of osteogenic genes and FTO. Overexpression of FTO increased expression of the osteogenic genes Dlx5 and Runx2. Activation of adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) increased FTO expression, and there was a positive feedback loop between FTO and pAMPK. pAMPK and FTO induced mild ER stress, however, tunicamycin induced severe ER stress suppressed FTO expression and AMPK activation. In summary, FTO induced osteogenic differentiation of C3H10T1/2 cells upon BMP2 treatment by inducing mild ER stress via a positive feedback loop with pAMPK. FTO expression and AMPK activation induce mild ER stress. By contrast, severe ER stress inhibits osteogenic differentiation by suppressing FTO expression and AMPK activation.