본 연구는 천연물 제초활성 물질을 탐색하기 위해 수행 되었으며, 살초활성을 갖는 토양 방선균 streptomyces scopuliridis KR-001균주를 발굴하였다. KR-001의 배양여액은 살초력의 발현이 매우 속효성이며 약효 지속효과도 상당히 길게 유지되는 살초특성을 확인하였다. 경엽처리의 경우 24시간 후부터 외형적인 살초증상이 발현되기 시작하여 3일 후에 대부분의 잡초를 고사시켰으며, 처리 10일 이후에도 효과가 지속되었다. 외형적으로 발현되는 주된 증상은 고사(burndown)이었으며, 일부 초종에서는 괴사(necrosis)증상도 발현되었다.
KR-001 배양여액 농축물과 2종의 방선균 유래 제초제 glufosinate-ammonium, bialaphos는 화본과잡초와 광엽잡초 구분 없이 우수한 살초력을 나타내었는데 살초력 정도는 세 약제 모두 비슷한 수준이었다. 시험약제 처리구에서는 1주일 이후에도 재생되는 개체가 없는 것을 보여 약효지속 효과가 장기간 유지되는 것으로 판단 되어 기존 제초제와 대등한 약효를 확인 할 수 있었다.
또한, 용매분획과 물질분리 과정을 통해 유효활성물질이 herbicidin A라는 것을 밝혔다. 더불어 유효활성 물질의 생산량을 증가시켜 천연물제초제로서의 가치를 상승하기 위해 균주개량과 배양최적화연구를 수행하였다. UV광과 NTG(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine)약품을 활용한 cross mutation을 통해 wild type KR-001보다 herbicidin A의 생산량이 3배 증가한 N29균주를 개발하였다. 이 N29 균주에 대한 배양최적화 연구를 통해 최적화된 탄소원, 질소원, 미량원소를 탐색하였고 배양조건 탐색연구와 더불어 herbicidin A의 함량이 2.5배 증가한 조건을 확립하였다. 최종적으로 wild type에 대비하여 herbicidin A의 함량이 20배 증가한 연구결과를 확보하였다. 또한 추가로 수행한 herbicidin A의 제초활성을 증진 시킬수 있는 adjuvant를 탐색한 결과 EP4C와 LE7이 유효성분의 약효를 우수하게 증가시킨다는 것을 확인 할 수 있었다. EP4C와 LE7 두 전착제간의 차이는 EP4C에서 화본과잡초의 활성을 증진 시키는 것으로 확인 되었다.
유효 제초활성 물질 herbicidin A의 작용기작을 탐색하기 위해 제초활성을 평가한 결과, 약효 발현속도나 증상의 측면을 고려할 때 광합성 저해 제초제인 Paraquat와 글루타민 생합성 저해 제초제인 Glufosinate-ammonium의 중간 정도로 판단하여 위 두 가지 제초제와 Oxyfluorfen, Glyphosate를 추가 대조약제로 하여 작용기작 구명을 위한 실험을 진행하였다. 다섯 가지 물질을 오이자엽대 대하여 처리하여 엽록소 함량을 측정한 결과, Paraquat와 Oxyfluorfen은 농도의존적으로 급격하게 엽록소 함량이 변화하지만, Glufosinate-ammonium과 Glyphosate의 경우에는 그 변화폭이 Paraquat에 비하여 매우 미미하였다. 또한 herbicidin A 처리구는 Oyfluorfen 보다는 엽록소함량의 변화가 적고 glufosinate ammonium 보다 변화가 커진 것으로 확인 되었다.
Herbicidis A가 전해질 누출에 미치는 영향을 확인하기 위해 수행한 본 실험은 엽록소 햠량에 미치는 영향을 조사한 실험과 같은 대조약제를 사용하였고 유효 제초활성 물질간의 뚜렷한 차이를 나타내었다. 광 조사 12시간 후에 전도도의 변화량 정도를 측정한 결과, Glyphosate아 glufosinate-ammonium의 경우 무처리구와 비교하였을 때, 시험농도 범위에서 전해물질 누출량의 차이가 거의 없었다. 5가지 물질을 처리하여 시간이 경과하면 궁극적으로는 세포막이 파괴되지만, Paraquat와 oxyfluorfen(PPO 작용기전)의 경우에는 활성 산소를 생성하여 세포막을 직접 파괴하는 작용기작을 갖는 제초제이므로 12시간 후에 상대적으로 다른 두 대조약제에 비해 전해물질 누출량이 높게 측정 되었으며, Herbicidin A의 경우에 처리 12시간 후의 전해물질 누출 정도가 Paraquat, oxyfluorfen과 Glufosinate-ammonium, glyphosate의 중간이지만 전자에 비해서는 현저하게 낮기 때문에 광계1이나 PPO와는 다른 살초기전을 발휘할 가능성이 높은 것으로 판단되었다. 또한, 같은 대조약제를 사용하여 MDA 생성 시험을 수행하였다. 지질 과산화의 지표로서 사용되는 MDA의 생성량을 측정하였을 때, 전해질 누출 변화량과 마찬가지로 herbicidin A의 MDA생성량은 Paraquat와 Oxyfluorfen과 비교하면 상대적으로 낮았고, Glufosinate-ammonium와 glyphosate보다는 높게 나타났지만 큰 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과로부터 herbicidin A의 식물체내 주요 작용기작은 Paraquat와 같은 광합성 저해는 아닌 것으로 판단하였다. 한편, herbicidin A는 glufosinate-ammonium과 비교에서도 다르지만 비슷한 경향을 보이는 결과를 토대로 유효 제초활성물질 herbicidin A는 Glufosinate-ammonium과 활성을 비교하는 추가 실험을 수행할 필요성이 있다고 판단하였다. 시금치로부터 crude GS enzyme을 추출하고 glufosinate ammonium과 herbicidin A를 1nM 농도부터 1/10씩 희석하여 처리한 결과 glufosinate ammonium은 완벽한 저해곡선을 그리면 활성을 저해하는 모습을 보였고 Hebicidin A는 높은 농도까지 전혀 저해하지 않는 다는 결과를 확인 했다. 이로써 herbicidin A의 작용기작은 글루타민 생합성효소를 저해하는 작용기작과는 명백하게 다르다는 것을 확인 할 수 있었다.

With increasing environmental issues from Organic synthetic chemical herbicides, Naturally derived ingredients could be a fascinating alternative in current agriculture.
We isolated Streptomyces strains that produced herbicidal active metabolite(s) against a grass weed Digitaria sanguinalis. According to the result from 16S rDNA sequence comparison with the close strains, the best isolate was identified as Streptomyces scopuliridis KR-001.
Among several previously reported as a bacteriocin producers, the selected strain was found to be closest to Streptomyces scopuliridis RB72. Herbicidal symptoms of the culture broth concentrate of S. scopuliridis KR-001 by foliar application were wilting and burndown of leaves, and stems followed by discoloration and finally plant death. Phytotoxicity has also been observed in crops such as rice, wheat, barley, peppers and tomatoes. These results suggest that the new S. scopuliridis KR-001 strain producing herbicidal metabolites may be a new bio-herbicide candidate and/or may provide a new lead molecule for a more efficient herbicide. The chemical analysis process established that the effective active substance is herbicidin A. Research was conducted in many ways to increase the amount of herbicidin A produced by selected strains. A mutagenesis study was conducted to increase the amount of active substance. As a result, the mutant N29 strain was developed with three folds higher herbicidin A than the wild type. In addition, by further improving the culture conditions, the study results that finally increase the production of herbicidin A by about 20 times. And, commonly used 21 adjuvants mixed with the metabolites were applied to eight weed species (six grass weeds and two broadleaved weeds). Based on the visual evaluation, two adjuvants, LE7 (Polyoxyethylene lauryl ether) and EP4C (Sodium bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate), were selected as most efficient adjuvants to elevate herbicidal efficacy of the metabolites. In addition to the previous results, a study was conducted comparing the commercialized herbicides to confirm the herbicidal properties of herbicidin A. At post-emergence application, the major phytotoxic symptoms of herbicidin A to several weeds was wilting within 24hrs and appeared quickly than those caused by glyphosate but slowly than that of paraquat. The phytotoxic activity of herbicidin A appeared with a time interval similar to glufosinate ammonium following foliar application. Chlorophyll loss and membrane lipid peroxidation are typical indicators of phytotoxicity for active compounds of synthetic organic herbicide such as photosynthesis inhibitor or Protox inhibitor. Also, herbicidin A slightly increased malondialdehyde(MDA) production as concentration-dependent manners. Phytotoxicities of paraquat is known to be due to reactive oxygen species(ROS) generated through the diversion of electron flow from photosystem I, and glufosinate-ammonium is non-selective herbicide that kills plants inhibiting the enzyme glutamine synthase(GS). Compared to causing cellular leakage, herbicidin A was much lower than paraquat and higher than glufosinate-ammonium. On the other hand, herbicidin A may have another mechanism of action than the inhibition of glutamine biosynthesis. To compare the herbicidal chracteristics of glufosinate ammonium and herbicidin A, an experiment was carried out by extracting GS enzyme from spinach. As a result, glufosinate ammonium increased enzyme activity as concentration increased, but herbicidin A showed no response at higher concentrations. Our results suggest that the mode of action herbicidin A is at least partly due to the differential action mechanism(s) by the paraquat or glufosinate-ammonium. Therefore, herbicidin A may provide a new molecule for a more efficient herbicidal effect to control of weeds.