효소면역법(Enzyme-Linked Immunospecific Assay) 방법은 임상시료내 단백질 정량 분석을 위한 대표적인 방법으로 특정 단백질은 특정 단백질과 결합한다는 사실을 이용한 방법이다. 채혈 등의 방법으로 얻을 수 있는 임상시료의 양은 언제나 한정적이며 최대한 미량의 시료를 이용하여 동일한 결과를 얻어내는 기술이 필요하다. 마이크로어레이 기술은 작은 기판상에 항체와 같은 생체 수용기를 마이크로 사이즈 단위로 집적한 기술로 기존 방식과 동일한 양의 시료를 활용하여 다수의 단백질을 동시 분석 할 수 있는 기술이다. 마이크로어레이 기술은 마이크로 사이즈 단위에 생체 수용기를 집적하기 때문에 그 신호 값이 낮을 수 밖에 없는 한계가 존재한다. 신호 값이 낮으면 해당 항원의 농도가 높은 검체에 대해서는 우수한 검출 성능을 보이지만 저 농도 검체에 대해서는 우수하지 못한 검출 성능을 보여 저농도 시료 검출이 필요한 분야에 활용이 어렵다. 또한 신호 값이 낮으면 그 기술의 일관성 및 신뢰성을 확보 할 수 없어 질병진단에 활용 할 수 없는 문제가 있다. 따라서 신호 값을 높여 낮은 농도 시료에 대한 일관성 및 신뢰성을 높이는 것은 질병진단응용에 마이크로어레이 기술을 적용하기 위해 필수적으로 극복해야 하는 문제라고 할 수 있다. 따라서 금속 나노 구조에서 방생하는 Surface plasmon 공진 효과를 이용하여 신호 값을 증폭 시켜주는 기술이 제안되었다. 하지만 전 면적에 금속 나노 구조가 형성되었을 경우 Antibody probe가 결합된 구역뿐만 아니라 주위 Background noise 영역의 신호 역시 증폭되어 기존 마이크로어레이와 유사한 Signal-to-Noise ratio (SNR)을 획득하게 된다. 또한 전 면적의 금속 나노 구조로 인하여 액적을 spotting 하였을 시 모세관 현상에 의해 Antibody probe의 결합이 제각각 다른 모양을 형성하는 한계가 있다. 본 연구에서는 Micropillar 구조의 기판을 제작하고 GLAD 공정을 통해 선택적으로 Micropillar 상단부에 금속 나노 구조를 형성하여 초점이 맞는 Micropillar 상단부의 신호는 증폭되고 초점이 맞지 않는 주변 Background noise 영역의 신호는 절감하는 효과와 Micro pillar 상단부에 정확하게 액적이 맺히도록 하여 모든 spot의 형상을 동일하게 만든 마이크로/나노 강화형광기판를 사용하였다.
마이크로/나노 강화형광기판은 micropillar 상단에 은 나노구조가 성장되어 있는 형태이며 scanner를 이용하여 검출 시 레이저의 초점이 micropillar 상단에 맞게끔 설계하여 초점이 맞는 상단부의 신호는 증폭되고 초점이 어긋난 하단부(background noise area)의 신호는 감소되는 원리를 이용하여 향상된 SNR를 얻을 수 있다. 마이크로/나노 강화형광기판의 경우 micropillar 상단의 은 나노 구조에 antibody probe를 고정시켜 형광시료에 대한 검출을 수행하게 되는데 일반 기판과 달리 micropillar 구조에 antibody 시료를 정확히 spotting 할 수 있도록 지정된 위치에 spotting 이 가능한 alignment spotting equipment를 사용하였다. 마이크로/나노 강화형광기판을 제작하기 위하여 우선 UV imprintin공정을 통하여 micropillar 구조를 제작하였으며 micropillar 상단에 선택적으로 은 나노구조를 만들기 위하여 회전경사증착 기법을 이용하였다.
개발된 마이크로/나노 강화형광기판을 이용한 응용으로 다중 바이오마커에 대한 동시 정량분석이 가능한 마이크로어레이를 개발하였다. 문헌 검색을 통하여 아토피 피부병 질환과 관련이 있는 바이오마커를 선정하고 이를 개발된 마이크로/나노 강화형광기판상에 spotting하여 마이크로어레이칩을 구현하였다. 다중 바이오마커에 대한 단백질 정량 가능 여부를 확인하기 위하여 6종의 농도를 알고 있는 표준시료를 임의의 농도로 혼합하고 정량 분석을 수행하여 정량 유효성을 검증하였다. 다음 실제 임상시료에 대한 정량 가능 여부를 확인하기 위하여 6종의 capture antibody가 적용된 나노/마이크로 강화형광기판을 제작하였으며 임상시료에 대한 정량 결과를 ELISA KIT의 정량 값과 비교함으로써 임상시료에 대한 정량 정확도를 검증하였다.

Enzyme-Linked Immunospecific Assay method is a representative method for quantitative analysis of protein in clinical samples, using the fact that a specific protein binds to a specific protein. The amount of clinical sample that can be obtained by a blood collection method is always limited, and there is a need for a technique for obtaining the same result using a small amount of samples. Microarray technology is a technology that integrates a bioreceptor such as an antibody in a micro size unit on a small substrate, and can simultaneously analyze multiple proteins using the same amount of sample as in the ELISA Kit method. Because microarray technology integrates bioreceptors into micro-size units, there is a limit to the low signal value. If the signal value is low, it shows excellent detection performance for samples with high concentrations of the antigen, but poor detection for low concentration samples, making it difficult to use in applications requiring low concentration samples. In addition, if the signal value is low, there is a problem that can not be used for disease diagnosis because the consistency and reliability of the technology can not be secured. Therefore, increasing the signal value to increase the consistency and reliability of low concentration samples is an essential problem to overcome in order to apply Microarray technology to disease diagnosis applications. Therefore, a technique for amplifying signal values using surface plasmon resonance effects occurring in metal nanostructures has been proposed. However, when the metal nanostructure is formed over the entire area, the signal in the surrounding background noise region as well as the region where the antibody probe is coupled is amplified to obtain a signal-to-noise ratio (SNR) similar to that of the existing microarray. In addition, due to the metal nanostructure of the entire area, when the droplets are spotted, there is a limit that the binding of the antibody probe forms a different shape due to the capillary phenomenon. In this study, we fabricated a micropillar-structured substrate and selectively formed a metal nanostructure on the top of the micropillar through the GLAD process to amplify the signal at the top of the focused micropillar and reduce the signal in the background noise area that is out of focus. Micro / Nano hierarchy MEF Microarray was used to make droplets form exactly on top of the micro pillars and to make all spots identical. Micro / Nano hierarchy MEF Microarray is a type of silver nanorods grown on top of the micropillar structure, and when the fluorescence signal is detected using a microarray scanner, the laser focuses on the top of the micropillar structure to amplify the signal at the top of the focused area. The signal of the background area out of focus can be secured using the principle of reduction. In the case of the Micro / Nano hierarchy MEF microarray, the detection of fluorescent labeling samples is carried out by immobilizing antibody probes on silver nanorods on the top of the micropillar structure. We used alignment spotting equipment that can be spotted selectively. In order to fabricate the micro / Nano hierarchy MEF microarray, micropillar structure substrates were fabricated by UV imprintin process, and rotational gradient deposition was used to selectively grow silver nanorods on top of the micropillar structure.
By using the developed Micro / Nano hierarchy MEF microarray, we have developed a microarray capable of simultaneous quantitative analysis of multiple biomarkers. First, biomarkers related to atopic disease were selected through literature search, and microarray chips were implemented by spotting them on the developed Micro / Nano hierarchy MEF microarrays. In order to confirm the possibility of quantification of multiple biomarkers, microarrays to which six kinds of capture antibodies were applied were prepared, and quantitative analysis was performed on samples mixed with six standard samples at arbitrary concentrations, and the results were quantitatively determined by ELISA KIT. The reliability of the substrate was verified by comparing with the value. In order to confirm the possibility of quantification of the actual human sample, microarrays to which six kinds of capture antibodies were applied were prepared.