독성발현경로 (AOP, Adverse Outcome Pathway)는 개별 수준에서 관찰되는 분자수준초기현상 (MIE, Molecular Initiating Event)으부터 최종악영향 (AO, Adverse Outcome)까지 독성 메커니즘을 설명하는 생물학적 지도이다. AOP는 MIE, 하나 이상의 주요사건 (KE, Key Event) 및 AO로 구성된다. 복잡한 생물학적 독성 경로를 반영할 수 있는 AOP 네트워크 (AOPN, AOP Network)를 형성하기 위해 개별 AOP를 조립할 수 있다. AOP의 주요 원칙 중 하나는 기존 지식의 사용을 최대화하는 것이므로 다양한 소스의 데이터를 사용하여 AOP를 개발할 수 있다. 이 다양한 데이터를 사용하려면 컴퓨터 접근법을 적용해야한다.
2007년 미국국립연구위원회 (NRC)는“21세기 독성 테스트: 비전과 전략”을 발표했다. 이 보고서는 발전된 in vitro 분석 및 고속대량스크리닝 (HTS, High Throughput Screening) 시스템을 기반으로 컴퓨터 모델을 통해 실험동물과 독성 시험 시간 및 비용을 줄이는 방법을 제안했다. 이와 관련하여, in vivo에서 확인된 독성에 대해 in vitro 분석 반응을 확인하기 위해 ToxCast 프로그램이 등장하였다. 현재 ToxCast 데이터베이스에는 1,192 개의 생체 표적에 대한 9,076 개 화학물질의 독성 데이터가 포함되어 있다. 그러나 화학물질의 독성 평가에서 개별 생물학적 표적에 대한 독성 데이터를 사용하는 데에는 한계가 있다.
인간은 흡입 경로를 통해 입자, 섬유, 나노물질, 가스 및 휘발성 유기화합물과 같은 수많은 환경화학물질에 노출된다. 그러나 흡입 독성을 일으키는 화학물질의 기존 독성평가는 비용이 많이 소모될뿐만 아니라 기술적으로 어렵고 시간도 많이 걸린다. 다수의 화학물질의 잠재적 흡입 독성을 효과적이고 신속하게 스크리닝하기 위해서는 흡입독성 스크리닝을 위한 AOP가 필요하다.
본 연구의 전체적인 목표는 1) 흡입독성 스크리닝을 위한 AOPN 개발; 2) AOP 개발에서 컴퓨터 접근법의 이용 가능성을 탐구하고, 그리고 이를 기반으로 흡입독성 스크리닝 통합시험전략을 제안하는 것이다. 이러한 목표를 달성하기 위해 다음과 같은 연구가 수행되었다.
첫째, 폐섬유화에 대한 AOPN을 개발하였다. AOP는 폐섬유화의 메커니즘과 관련된 문헌 정보를 사용하여 개발되었다. AOP의 전반적인 평가를 위해 문헌 검토가 수행되었고, Bradford-Hill 고려 사항에 따라 평가되었다. 각 KE의 전반적인 생물학적 타당성 및 필수성은 높지만 경험적 지지와 양적 관계는 중간 또는 약함이다.
둘째, ToxCast 데이터베이스 및 딥러닝 모델을 사용하여 AOP 검증을 위한 잠재적 화학물질을 식별하였다. 먼저 데이터베이스에서 잠재적 흡입 유해성 및 노출 가능성이 있는 화학물질을 확인하였다. 그런 다음 ToxCast 데이터베이스와 딥러닝 인공신경망 모델을 사용한 체계적인 분석을 통해 이 AOP와 관련된 잠재적 화학물질을 식별하였다. ToxCast 데이터베이스와 딥러닝 모델 모두 AOP 검증에 사용할 수 있는 화학물질 세트를 식별하였다.
셋째, in silico 분자도킹 및 in vitro 분석을 이용하여 MIE를 검증하였다. 먼저 잠재적인 화학물질의 구조를 이용하여 MIE에 대한 분자도킹을 수행하였다. PPARγ 수용체에 대한 결합에너지가 낮은 화학물질 중에서, rotenone, triorthocresyl phosphate, castor oil이 AOP의 MIE의 검증을 위한 PPARγ 길항제로 선택되었다. 이러한 결과는 분자도킹 접근법이 MIE를 식별하기 위해 적용될 수 있음을 시사한다.
넷째, 베이지안네트워크 (BN, Bayesian Network) 모델을 사용하여 KE 간의 인과관계를 확인하였다. 이전 연구로부터 섬유화 및 세포 사멸과 관련된 바이오마커에 대한 in vitro 시험 데이터를 수집하였다. 이 데이터를 바탕으로 섬유화를 유발하는 스트레스 반응에 대한 AOP가 개발되었으며, KE 간의 확률적 인과관계를 확인하기 위해 BN 모델이 학습되었다. 각 KE의 영향은 MWCNT의 노출에 따라 변하였다. 전체적으로, BN 모델이 AOP에서 인과관계를 확인할 수 있음을 보여주었다.
마지막으로, 환경화학물질의 독성경로를 확인하기 위해 딥러닝을 적용한 사례 연구를 수행하였다. 미세먼지 (PM2.5)의 독성 및 함유된 개별 화학물질의 독성 메커니즘이 체계적으로 식별되었다. ToxCast 데이터베이스와 딥러닝 모델을 사용하여 각 생물학적 표적에 대한 활성 화학물질을 확인하였다. 분자도킹 및 in vitro PPARγ 활성 분석을 통해, 미세먼지의 폐섬유화에 대한 가능성을 확인하였다. 이 연구는 in silico 접근법과 실험 검증이 환경화학물질의 독성경로를 예측하는 데 유용하고 효율적인 도구라고 제안했다.
이러한 연구를 종합하여, 데이터베이스와 개발된 흡입독성 AOP를 기반으로 흡입독성 물질 스크리닝을 위한 ITS를 제안하였다.
이 연구에서 사용된 컴퓨터 접근법은 다양한 소스와 유형, 특히 다른 방법으로 생성된 데이터를 활용할 수 있도록 한다. 이는 기존 지식의 사용을 극대화하는 것을 목적으로 하는 AOP에 적합한 접근 방식이다. 빠르게 발전하는 컴퓨터 기술과 AOP의 통합은 메커니즘 기반 화학물질 독성평가를 가속화하는 새로운 방향이 될 것이다.

Adverse Outcome Pathway (AOP) is a biological map describing toxicity mechanisms from molecular initiating event to apical adverse outcome, as observed at the individual level. AOP consists of a Molecular Initiating Event (MIE), one or more Key Events (KEs), and an Adverse Outcome (AO). Individual AOPs can be assembled to form an AOP network (AOPN) to reflect complex biological toxicity pathways. One of the key principles of AOP is to maximize the use of existing knowledge, so data from a variety of sources are used to develop AOP. The use of this diverse data requires the application of a computational approach.
In 2007, US National Research Council (NRC) presented “Toxicity Testing in the 21th Century: A Vision and a Strategy”. This report proposed an approach to reduce animal, the time and cost of toxicity testing through advanced in vitro assays and computational models, such as the High Throughput Screening (HTS) system. In this context, ToxCast (Toxicity Forecaster) program has emerged to confirm the response by in vitro assays for toxicity identified in in vivo. ToxCast database contains 9,076 chemical toxicity data for 1,192 bioassays. However, there are limitations to using toxicity data on individual biological targets in the toxicity assessment of chemicals.
Humans are exposed to numerous environmental chemicals such as particles, fibers, nanomaterials, gases, and volatile organic chemicals through inhalation pathways. However, the traditional toxicity assessment of chemicals causing inhalation toxicity are not only very expensive, but also technically difficult and time consuming. In order to efficiently and rapidly screen the potential inhalation toxicity of a large number of chemicals, the AOP for inhalation toxicity screening is required.
The overall aims of this project were to 1) develop AOPN for inhalation toxicity screening; and 2) explore the availability of some computational approaches in the development of AOP and propose an inhalation toxicity screening Integrated Testing Strategy (ITS). In order to achieve these aims, the following studies were conducted.
First, development of AOPN on pulmonary fibrosis was conducted. The AOP was developed using information from the literature related to the mechanism of pulmonary fibrosis. For an overall assessment of the AOP, a literature review was conducted and the AOP was evaluated based on the Bradford-Hill considerations. The overall Biological Plausibility and Essentiality of each KE are high, but the Empirical support and quantitative relationships are moderate or weak.
Second, identification of potential chemicals for AOP validation was conducted using ToxCast databases and deep learning models. Chemicals bearing potential inhalation hazard and exposure hazards were identified from the database. Then the systematic analysis was conducted to identify potential chemicals involved in this AOP, using the ToxCast database and deep learning artificial neural network models. The activity of chemicals do not tested in ToxCast were then predicted using these deep learning models. Both approaches identified a set of chemicals that could be used to validate the AOP.
Third, MIE validation was conducted using in silico molecular docking and in vitro assay. On the potential chemicals, MIE was validated first with in silico approach using molecular docking. Among the chemicals having low binding energy to PPARγ receptor, rotenone, triorthocresyl phosphate, and castor oil were selected as PPARγ antagonist for validation of MIE of this AOP. These results suggested that in silico molecular docking approach has a potential to be applied for identifying MIEs.
Fourth, the causal relationship between KEs was identified using Bayesian Network model. The in vitro test data on the biomarkers related to fibrosis and cell death were collected from the previous studies. Based on these data, AOP of stress response leading to fibrosis was developed, and BN model was learned for identifying probabilistic causal relationships between the KEs. The effect of KE was altered by the exposure of MWCNTs. Overall, our approach shows that BN modeling has the potential to identify causal relationships in an AOP.
Lastly, we applied AOP approach in a case study to identify the toxicity pathways of environmental chemicals, such as, PM2.5. Mechanism of toxicity of individual chemicals in PM2.5 were systematically identified. Using both the ToxCast database and deep learning models, active chemicals on each biological target were identified. Through molecular docking and in vitro PPARγ activity assay, potential for pulmonary fibrosis of DPM were identified. This study suggested that in silico assay combined with experimental validation is a useful and efficient tool for predicting environmental chemicals.
Based on these studies, we proposed Integrated Testing Strategy (ITS) for screening inhalation toxicants based on database and developed inhalation toxicity AOP.
The computational approaches, used in this study, make it possible to utilize data from a variety of sources and types, especially those produced by different methods. This is a suitable approach for AOP aimed at maximizing the use of existing knowledge. The integration of AOP with rapidly developing computer technologies will be a new direction to accelerate mechanism-based chemical toxicity assessment.