Protective Effects and Mechanisms of Paeonia lactiflora against Neuronal Oxidative Stress :산화적 스트레스로부터 작약의 신경세포 보호 효과 및 작용 기전

Mi Na Nam

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자료유형: 학위논문

저자정보: Mi Na Nam (부산대학교, 부산대학교 대학원)

지도교수: Eun Ju Cho

발행연도: 2019

저작권: 부산대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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이 논문의 연구 히스토리 (3)

2019

Protective Effects and Mechanisms of Paeonia lactiflora against Neuronal Oxidative Stress

Mi Na Nam 식품영양학과 2019.01 학위논문

2018

Protective Effects of Paeonia lactiflora and Paeoniflorin from Neuronal Oxidative Stress Induced by Aβ_25-35 in SH-SY5Y Cells

Mi Na Nam , Ah Young Lee , Seung Mi Sin 외 2명 한국식품영양과학회 학술대회발표집 2018.10 학술대회자료

Protective Effects of Paeonia lactiflora and Its Active Compound, Paeoniflorin, from Neuronal Oxidative Stress under H₂O₂-Treated SH-SY5Y Cells

Mi Na Nam , Seung Mi Sin , Young-Min Goo 외 2명 한국식품영양과학회 학술대회발표집 2018.10 학술대회자료

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전 세계적으로 고령 인구가 증가함에 따라, 신경퇴행성 질환인 알츠하이머 질환(Alzheimer''s disease, AD)의 유병률 또한 증가하고 있다. AD는 비정상적인 amyloid beta (Aβ) plaque의 축적으로 인한 산화적 스트레스, 염증, 뇌세포 사멸이 주요 원인으로, 이는 기억력 감퇴, 판단력 저하 등의 인지능 상실을 가져온다. 사물탕과 그 주재료인 작약(Paeonia lactiflora)의 항염증, 항종양, 항산화, 항응고제, 진정 작용 및 진통 작용에 대한 연구는 많이 보고되어 왔으나, Aβ로 유도된 알츠하이머 질환에 대한 보호 효과 및 그 기전에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 사물탕, 작약 그리고 작약의 주요 활성물질인 paeoniflorin을 이용하여 산화적 스트레스로부터 신경세포 및 신경교세포 보호 효과와 Aβ를 생성하는 amyloid precursor protein (APP) processing 조절 작용 기전에 대해 연구하였다. 먼저 사물탕은 in vitro에서 항산화 효과 및 hydrogen peroxide(H2O2)로 유도된 산화적 스트레스로부터 SH-SY5Y neuronal cell 보호 효과를 나타냈으며, 사물탕의 네 가지 재료 중 작약의 항산화 활성이 가장 높게 나타나, 사물탕의 항산화 활성이 작약에서 기인된 것임을 확인할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 작약과 작약의 주요 활성 물질인 paeoniflorin을 이용하여 신경교세포 보호 효과와 그 작용 기전을 알아본 결과, H2O2로 유도된 C6 glial cell 손상 및 사멸 억제 효과를 확인할 수 있었다. 또한 작약과 paeoniflorin은 H2O2와 Aβ로 유도된 뇌세포 사멸, 산화적 스트레스로 인한 신경세포 손상으로부터 보호 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 게다가 작약과 paeoniflorin은 Aβ를 생성하는 APP processing 대사과정을 조절함으로써, Aβ로 유도되는 신경독성 또한 감소시키는 것으로 확인되었다. 따라서 작약과 그 주요 활성 물질인 paeoniflorin은 신경세포 사멸, APP 생성에 관여하는 단백질 발현 억제 및 경로 하향 조절 작용을 통해 알츠하이머 질환과 같은 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료에 도움을 줄 것으로 기대된다.

Alzheimer''s disease (AD) caused by the accumulation of amyloid beta (Aβ) plaques, leads to inflammation and neuronal cell death, resulting in cognitive dysfunction and memory loss. Samultang and Paeonia lactiflora (PL) have been reported to possess health benefit effects such as antiinflammatory, antitumor, antioxidant, anticoagulant, antisedative and antianalgesic activity. However, the neuroprotective mechanisms of PL against oxidative stress and Aβ-induced amyloid beta precursor protein (APP) processing have not been evaluated yet. Therefore, we investigated the antioxidant and protective effects of Samultang and its four herbal plants against hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative stress under in vitro and cellular system. First, Samultang showed protective effects against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), hydroxyl radical (·OH), and nitric oxide (NO) and H2O2-induced neuronal cell death. In addition, its four herbal plants, Paeonia lactiflora (PL), Ligusticum striatum, Rehmannia glutinosa, and Angelica gigas, showed strong scavenging activities of DPPH, OH, and NO radicals. Especially, PL had the highest antioxidative activity among the four materials of Samultang. Based on these results, we investigated the neuroprotective effects and mechanisms of PL and its major active compound, paeoniflorin (PF). Therefore, we evaluated the protective effects of PL and PF from oxidative stress induced by H2O2 in C6 glial cells and SH-SY5Y neuronal cells. In our results, treatment with PL and PF significantly attenuated H2O2-induced cell death as shown by increased cell survival, inhibition of lactate dehydrogenase release and reactive oxygen species production. Also, the treatment of PL or PF down-regulated the pro-apoptotic B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)-associated X protein and up-regulated the anti-apoptotic Bcl-2 protein. The apoptosis-related protein expressions including cleaved caspase-9, -3 and, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), were significantly decreased by the treatment with PL and PF. Furthermore, we examined the protective effect of PL and PF on oxidative stress and neurotoxicity in SH-SY5Y cells under oxidative damage by Aβ25-35. In our results, PL and PF reduced Aβ-induced neurotoxicity by modulating APP metabolism. The treatment of Aβ25-35 up-regulated the proteins levels of APP-C-terminal fragment β, β-site APP-cleaving enzyme, presenilin-1, and -2. In contrast, PL and PF significantly down-regulated the expression of proteins related with amyloidogenic pathway. In conclusion, among four herbal plants of Samultang, PL and its primary active compound, PF, showed the strongest antioxidant activities against H2O2-induced C6 glial and SH-SY5Y neuronal cells damage. In addition, PL and PF attenuated neuronal apoptosis via down-regulating the apoptosis-related protein expressions. Moreover, PL and PF regulated APP processing by inhibiting amyloidogenic pathway. Taken together, PL is expected to be a potential agent for oxidative stress-related neuronal cell death and Aβ-induced neurotoxicity by regulation of neuronal apoptosis, APP processing, and Aβ degeneration, and these effects were contributed by PF, a major compound of PL.

#Paeonia lactiflora #Paeoniflorin #Hydrogen peroxide #Amyloid beta #Neuronal oxidative stress #Alzheimer''s disease

PART Ⅰ. Protective Effect of Samultang and Its Four Herbal Plants from Reactive Oxygen species under in Vitro and Cellular System 1
Abstract 1
1. Introduction 2
2. Materials and methods 3
2.1. Preparation of samples 3
2.2. Instruments and reagents 3
2.3. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay 4
2.4. Hydroxyl radical (·OH) scavenging assay 4
2.5. Nitric oxide (NO) radical scavenging assay 5
2.6. Cell culture 5
2.7. MTT assay 5
2.8. Measurement of reactive oxygen species (ROS) production 6
2.9. Statistical analysis 6
3. Results 7
3.1. DPPH, ·OH, and NO radical scavenging activity of Samultang 7
3.2. Effects of Samultang on cell viability in H2O2-treated SH-SY5Y cells 11
3.3. Effects of Samultang on ROS production in H2O2-treated SH-SY5Y cells 11
3.4. DPPH and ·OH radical scavenging activity of four herbal plants in Samultang 14
4. Discussion 17
5. Conclusion 18
6. References 20
PART Ⅱ. Protective Role of Paeonia lactiflora (PL) and Paeoniflorin (PF) against Oxidative Damage via Regulation of Apoptotic Pathway in C6 Glial Cells 25
Abstract 25
1. Introduction 26
2. Materials and methods 27
2.1. Preparation of samples 27
2.2. Instruments and reagents 28
2.3. Cell culture 28
2.4. MTT assay 29
2.5. Lactate dehydrogenase (LDH) release assay 29
2.6. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay 29
2.7. Measurement of superoxide dismutase (SOD) activity 30
2.8. Western blotting 30
2.9. Statistical analysis 31
3. Results 31
3.1. Effects of PL and PF on cell viability in H2O2-induced C6 glial cells 31
3.2. Effects of PL and PF on LDH release in H2O2-induced C6 glial cells 31
3.3. Effects of PL and PF on ROS production in H2O2-induced C6 glial cells 34
3.4. Effects of PL and PF on SOD activity in H2O2-induced C6 glial cells 34
3.5. Effects of PL and PF on the levels of Bax/Bcl-2 protein expression in H2O2-induced C6 glial cells 38
3.6. Effects of PL and PF on the levels of cleaved caspase-9, -3, and cleaved PARP protein expression in H2O2-induced C6 glial cells 38
4. Discussion 41
5. Conclusion 44
6. References 45
PART Ⅲ. Protective Effects and Mechanisms of PL and PF on Oxidative Stress Induced Apoptosis and Amyloid Precursor Protein (APP) Processing in Neuronal Cells 50
STUDY 1. Protective Effects of PL and Its Active Compound, PF, against Neuronal Oxidative Stress in H2O2-treated SH-SY5Y Cells 50
Abstract 50
1. Introduction 51
2. Materials and methods 53
2.1. Preparation of samples 53
2.2. Instruments and reagents 53
2.3. ·OH scavenging assay 53
2.4. NO radical scavenging assay 54
2.5. Cell culture 54
2.6. MTT assay 55
2.7. Measurement of intracellular ROS levels 55
2.8. LDH release assay 56
2.9. Hoechst 33342 staining 56
2.10. Western blotting 56
2.11. Statistical analysis 57
3. Results 58
3.1. ·OH and NO radical scavenging activities of PL and PF 58
3.2. Protective effects of PL and PF on H2O2-induced cell death in SH-SY5Y cells 58
3.3. Inhibitory effects of PL and PF on H2O2-induced intracellular ROS levels in SH-SY5Y cells 61
3.4. Protective effects of PL and PF on H2O2-induced LDH release in SH-SY5Y cells 61
3.5. Anti-apoptotic activities of PL and PF against H2O2 by staining with Hoechst 33342 in SH-SY5Y cells 64
3.6. Effects of PL and PF on H2O2-induced caspase-3, -9, and PARP activation in SH-SY5Y Cells 64
3.7. Effects of PL and PF on H2O2-induced Bcl-2/Bax protein expression in SH-SY5Y Cells 67
4. Discussion 69
5. Conclusion 73
6. References 74
STUDY 2. Neuroprotective Effects and Underlying Mechanisms of PL and PF against Aβ25-35-induced Neurotoxicity in SH-SY5Y Cells 85
Abstract 85
1. Introduction 86
2. Materials and methods 88
2.1. Preparation of samples 88
2.2. Instruments and reagents 88
2.3. Cell culture 89
2.4. MTT assay 89
2.5. LDH release assay 89
2.6. Measurement of ROS production 90
2.7. Hoechst 33342 staining 90
2.8. Western blotting 91
2.9. Statistical analysis 91
3. Results 91
3.1. Effects of PL and PF on cell viability in Aβ25-35-treated SH-SY5Y cells 91
3.2. Effects of PL and PF on LDH release in Aβ25-35-treated SH-SY5Y cells 92
3.3. Effects of PL and PF on ROS production in Aβ25-35-treated SH-SY5Y cells 92
3.4. Effects of PL and PF on morphological changes and DNA condensation in Aβ25-35-treated SH-SY5Y cells 96
3.5. Effects of PL and PF on the amyloidogenic pathway in Aβ25-35-treated SH-SY5Y cells 96
4. Discussion 100
5. Conclusion 103
6. References 105
SUMMARY AND CONCLUSION 113
ABSTRACT (In Korean) 115

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