나노 물질은 강도, 강성, 내열성 및 내구성과 같은 독특한 물리화학적 성질을 갖고 있어 여러 분야에서 다양하게 이용되는 귀중한 산업제품으로 주목을 받고 있는 물질이다. 그러나 이렇게 우리 주변에서 다양하게 이용되고 있는 나노 물질이 인체 내에 독성을 일으킨다는 의견이 제시되고 있다. 특히, 일본에서 제조되고 있는 Multi-walled carbon nanotube (MWCNT)인 Mitsui-7은 인체 내에 발암성을 일으킬 수 있는 IARC Group 2B에 속한다는 연구결과가 나왔다. 나노 물질 중에는MWCNT와 형태가 유사한 나노 물질인 Carbon nanofiber (CNF)가 있다. 이러한 MWCNT와 CNF는 다양한 공정으로 생산이 되는데 공정에 따라 물리화학적 특성이 다르게 나타난다. 따라서 본 논문의 목적은 국내에서 생산된 탄소기반 나노 물질 즉 MWCNT 및 CNF의 물리화학적 특성에 따른 발암성 차이를 확인하는 것이다.
시험물질의 발암성을 평가하기 위한 대체독성 시험법으로는 진행성 암의 특성을 고려한 비부착군락 형성 (anchorage independent agar colony formation), 세포 이동 (cell migration) 및 세포 침윤 (cell invasion) 분석 등을 사용하였으며 이러한 반응의 기전을 확인하기 위해 Anti-apoptosis pathway, MMPs pathway, EMT pathway 등 관련 단백질들의 발현에 대해 western blotting을 수행하였다. 우선적으로 국내 6개의 기업에 의해 준비된 Multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs)와 Carbon nanofibers (CNFs), 일본에서 제조되는 Mitsui 7을 비 종양 정상세포인 BEAS-2B 세포에 3일 동안 처치하였다. 용량 설정을 위해 Cristal violet (CV) assay와 Colony forming efficiency (CFE) assay를 수행하였고 세포 독성 여부를 확인한 후 세포독성이 20% 이하인 농도를 노출 농도로 선정하였다. 선정된 농도로 MWCNTs (1 ?g/ml, 10 ?g/ml) 및 CNFs (1 ?g/ml, 10 ?g/ml)를 BEAS-2B 세포에 약 4주간 처치한 후 악성형질전환을 평가할 수 있는 비부착군락 형성 시험을 수행한 결과 처치된 모든 세포에서 군락형성이 유의적으로 증가된 것을 확인하였다. 또한 세포 이동과 세포 침윤이 MWCNTs 및 CNFs를 처치한 모든 세포에서 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 노출된 BEAS-2B세포에서 발암성 세포로의 형질전환에 관여할 수 있는 다양한 단백질 발현을 Western blot으로 확인한 결과 MWCNT 1, MWCNT 2 및 Mitsui 7에서 예정세포사 억제와 관련된 Bcl-2의 증가와 Bax의 감소를 통해 anti-apoptosis가 증가되어 세포증식을 유도할 수 있음을 확인하였다. 또한 전이성 여부에 중요한 Caspase-3, Cleaved caspase-3, TIMP 1 및 TIMP 2를 확인한 결과 Caspase-3와 Cleaved caspase-3는 MWCNT 3와 MWCNT 4 그리고 Mitsui 7에서 증가하였고 TIMPs 또한 MWCNT 2, MWCNT 3, MWCNT 4 및 Mitsui 7에서 감소되어 MWCNTs와 CNFs에 노출된 BEAS-2B세포가 전이성 형질을 획득한 것임을 확인할 수 있었다. 그리고 Epithelial mesenchymal transition (EMT) 여부에 관련된 N-cadherin이 MWCNT 1, MWCNT 2, MWCNT 3, Mitsui 7 및 CNF 1에서 증가한 것을 확인하여 세포가 전이성 형질을 획득한 것임을 확인할 수 있었다.
이들 결과를 종합하였을 때 세포사멸, 산화적 스트레스 발생, 비부착군락 형성, 세포이동 및 세포침윤과 같은 통합 시험 방법을 통해 MWCNTs와 CNFs에 노출된 비 종양성 BEAS-2B 세포가 악성종양 형질전환과 전이성을 가지는 것을 확인하였다.

Nanomaterials have unique physicochemical properties such as strength, stiffness, heat resistance and durability, and are attracting attention as valuable industrial products that are widely used in various fields. However, it suggested that nanomaterials may cause toxicity in the human body. Especially, Mitsui-7, a multi-walled carbon nanotube (MWCNT) manufactured in Japan, belongs to IARC Group 2B, which can cause carcinogenicity in humans. Therefore, the purpose of this study is to investigate the differences of the carcinogenicity of the carbon-based nanomaterials (MWCNT and CNF) produced in Korea. In this study, we used anchorage independent agar colony formation, cell migration/invasion assay, and epithelial-mesenchymal transition (EMT) etc. as the integrated test methods for carcinogenic potentials. Non-tumorigenic BEAS-2B cells were exposed to MWCNTs and Carbon nanofibers (CNFs) for 3 days at non-cytotoxic concentration, which obtained from Colony forming efficiency (CFE) assay and Crystal violet (CV) assay. Anchorage independent colony formation, a hallmark of cell transformation has been considered the most stringent assay for detecting malignant transformation of cells. As a result, it was confirmed that the colony formation was significantly increased in all treated cells. Cell migration and invasion in treated BEAS-2B cells showed a significant increase compared to control. The mechanism studies for advanced carcinogenic effect was confirmed by western blot. As a result, Bcl-2 and Bax related to anti-apoptosis were Bcl-2 was increaced and Bax was decresed in MWCNT 1, MWCNT 2, and Mitsui 7. Caspase-3 and Cleaved caspase-3 related to cell migration/invasion were upregulated, while MMPs inhibitor, TIMP-1 and TIMP-2 were down-regulated in MWCNT 3, MWCNT 4, and Mitsui 7. In addition, EMT, which is the gain of mesenchymal marker (N-cadherin), was induced by chronic exposure to MWCNTs and CNFs. Collectively, our findings suggested that non-tumorigenic BEAS-2B cells exposed to MWCNTs and CNFs may acquire the metastasis potentials and the multiple characteristics of malignant tumors. These results suggest that non-tumorigenic BEAS-2B cells exposed to MWCNTs and CNFs can induce malignant tumor transformation and proliferation of tumor cells through integrated testing methods such as Anchorage independent agar colony formation, cell migration and cell invasion Metastatic.