저농도 NaCl 함유 체외발육 배양액이 Small Antral Follicle 유래 돼지 난자의 성숙과 배아 발달에 미치는 효과 :Effect of Reduced Sodium Chloride in a Medium during In Vitro Growth Culture on Maturation and Embryonic Development of Pig Oocytes Derived from Small Antral Follicles

신혜지

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자료유형: 학위논문

저자정보: 신혜지 (강원대학교, 강원대학교 대학원)

지도교수: 이은송

발행연도: 2018

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이 논문의 연구 히스토리 (2)

2018

저농도 NaCl 함유 체외발육 배양액이 Small Antral Follicle 유래 돼지 난자의 성숙과 배아 발달에 미치는 효과

신혜지 수의학과 2018.01 학위논문

2017

돼지 난자의 체외성숙에서 합성배양액에 첨가된 과당이 난자의 성숙 및 단위발생 배아의 체외발육에 미치는 영향

신혜지 , 김민지 , 이주형 외 4명 한국수정란이식학회지 2017.01 학술저널

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돼지 난소에서 직경 3 mm 미만의 작은 크기의 난포 small antral follicle (SAF) 유래 난자는 직경 3 mm 이상의 난포 유래 난자에 비해 낮은 발생능을 보이는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 저농도 NaCl이 포함된 체외발육 배양액이 SAF 유래 난자의 체외성숙과 배아 발달에 미치는 효과를 조사하였다. SAF에서 채취된 난자를 dibutyryl cyclic AMP (dbcAMP)와 소 태아 혈청이 첨가된 배양액에서 2일 동안 배양하여 난자의 발육을 유도하였다. 체외발육 배양액으로는 61.6 mM (PZM-61.6)또는 108 mM의 NaCl이 포함된 porcine zygote medium (PZM-108)과 108 mM NaCl이 첨가된 alpha-minimum essential medium (αMEM-108)을 이용하였다. 배양 ２일후 난자를 medium-199 배양액으로 옮겨 44시간 동안 추가 배양함으로써 난자의 성숙을 유도하였다.
제1극체가 배출된 성숙난자만을 선별하여 단위발생을 유도하거나 수핵 난자로 이용하여 체세포 핵이식 배아를 생산하였다. 실험 결과 체외발육 배양 동안 PZM-61.6에서 배양된 난자는 PZM-108 및 αMEM-108 배양 난자에 비해 유의적으로 높은 핵 성숙률을 보였으며 (88.0% vs 75.9-77.3%; P < 0.05), 단위발생 유도 후 유의적으로 높은 배반포 형성률을 보였다 (43.9% vs 32.9-37.3%; P < 0.05). 또한 체세포 핵이식 배아의 체외발육에 있어서도 PZM-61.6에서 체외발육된 난자가 PZM-108 및 αMEM-108에서 배양된 난자에 비해 유의적으로 높은 배반포 형성률을 보였다 (17.8% vs 7.5-11.4%; P < 0.05). SAF 유래 난자를 2일간 배양한 후 난자의 핵상을 관찰한 결과 PZM-61.6에서 배양된 난자가 PZM-108 및 αMEM-108 배양 난자에 비해 유의적으로 높은 핵막붕괴 germinal vesicle breakdown (GVBD)비율을 보였다 (43.0% vs 19.3-20.4%; P < 0.05). 체외발육-체외성숙을 유도한 난자의 perivitelline space (PVS) 크기를 측정한 결과 PZM-61.6을 이용한 체외발육 배양은 다른 배양액에 비해 체외성숙 난자의 PVS를 유의적으로 증가시켰으며 (12.1 μm vs. 7.4-8.0 μm; P < 0.05), 성숙 난자 내 glutathione (GSH) 함량도 PZM-61.6에서 배양된 난자에서 유의적으로 높게 나타났다 (1.19 vs 1.00-1.03 pixels/oocyte; P < 0.05). 본 연구의 결과 PZM-61.6 배양액을 이용한 난자 체외발육 배양법은 SAF 유래 난자의 핵 성숙 및 세포질 성숙을 개선함으로써 단위발생 및 체세포 핵이식 배아의 발육능을 증가시키는 것으로 나타났다.

This study was conducted to evaluate the effects of reduced sodium chloride (61.6 mM) in a medium during in vitro growth (IVG) on in vitro maturation (IVM) and embryonic development of pig oocytes derived from small antral follicles (< 3 mm in diameter). SAF oocytes were cultured for 2 days to induce IVG in porcine zygote medium (PZM)-3 containing 61.6 mM (PZM-61.6) or 108 mM NaCl (PZM-108) and alpha-minimal essential medium with 108 mM NaCl (αMEM-108). IVG medium was supplemented with dibutyryl cyclic AMP (dbcAMP) and fetal bovine serum. After IVG, oocytes were matured for 44 h. IVM oocytes were induced for parthenogenesis (PA) by electric activation or used as recipient ooplasts for somatic cell nuclear transfer (SCNT). IVG culture in PZM-61.6 significantly increased nuclear maturation (88.0%) of SAF oocytes compared to that in PZM-108 and αMEM-108 (77.3 and 75.9%, respectively). After PA, the proportions of blastocysts based on the number of metaphase II oocytes induced for PA were not different among IVG oocytes in PZM-61.6, PZM-108, and αMEM-108 (50.2, 46.8, and 45.6%, respectively). IVM oocytes derived from IVG in PZM-61.6 (12.1 μm) showed increased perivitelline space (PVS) and intraoocyte glutathione (GSH) content (1.19 pixels/oocyte) compared to PVS (8.0 and 7.4 μm, respectively) and GSH (1.03 and 1.00 pixels/oocyte, respectively) of oocytes derived from PZM-108 and αMEM-108. When nuclear status was examined, IVG culture in PZM-61.6 resulted in a higher proportion (43.0%) of oocytes at the germinal vesicle breakdown stage than those in PZM-108 and αMEM-108 (20.4 and 19.3%, respectively). Conversely, the proportion of oocytes at the GV stage was lower in PZM-61.6 (48.8%) than in PZM-108 and αMEM-108 (72.9 and 72.7%, respectively). After SCNT, SAF oocytes grown in PZM-61.6 showed a higher blastocyst formation (17.8%) than those grown in PZM-108 and αMEM-108 (7.5 and 11.4%, respectively). The results of this study clearly demonstrate that IVG culture of SAF oocytes in PZM-61.6 stimulates oocyte maturation and subsequent embryonic development after SCNT in pigs.

#Small antral follicle #Porcine zygote medium #Dibutyryl cAMP #Low-NaCl #In vitro growth #돼지 난자

초록 I
목차 III
LIST OF TABLES VI
LIST OF ABBREVIATIONS VIII
I. 서론 1
II. 재료 및 방법 4
1. SAF유래 난자의 채취 및 체외발육 4
2. 난자의 체외성숙 5
3. 체외성숙 난자의 세포질 내 glutathione 함량과 난자의 직경 측정 5
4. 난자의 단위발생 처리 6
5. 체세초 핵이식 및 난자 활성화 7
6. 후 활성화 이후 배아의 체외배양 7
7. 난자의 핵상 검사 8
8. 실험설계 8
9. 통계분석 9
III. 결과 10
1. 다양한 체외발육 기간이 SAF 유래 난자의 성장 및 성숙에 미치는 영향
10
2. 다양한 체외발육 배양 기간이 난자의 단위발생 이후 배아 발달에
미치는 영향 12
3. 저농도 NaCl함유 체외발육 배양액이 SAF 유래 난자의 체외성숙과 배아
발달에 미치는 효과 14
4. 저농도 NaCl 함유 체외발육 배양액이 SAF 유래 난자의 PVS와 GSH
함량에 미치는 영향 16
5. 저농도 NaCl 함유 체외발육 배양액이 SAF 유래 난자의 핵상에 미치는
영향 18
6. 저농도 NaCl 함유 체외발육 배양액이 체외성숙 22시간 이후 난자의
핵상에 미치는 영향 20
7. 저농도 NaCl 함유 체외발육 배양액이 SAF 유래 난자의 체세포 핵이식
이후 배 발육에 미치는 영향 22
IV. 고찰 24
V. 참고문헌 28
SUMMARY IN ENGLISH (영문초록) XI
감사의 글 XIII

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