갯벌은 해양과 육지의 중간지점으로써 주기적으로 바닷물에 노출되어 독특한 생물군집을 이룬다. 이 지역은 해안을 따라 퇴적물이 쌓여서 넓게 형성되는데, 토양의 성분, 자생식물, 해류 등의 영향을 받는다. 갯벌은 수생생물의 서식지이며 생태계 물질 순환을 위해 중요한 생태학적 역할을 한다. 특히, 갯벌의 토착 미생물은 다양한 오염물에 지속적으로 노출되며 이들의 분해에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근 이러한 갯벌 미생물을 이용한 생물학적 제재에 대한 연구가 활발하다. 이에 우리는 넓고 다양한 갯벌을 형성하고 있는 인천연안의 갯벌 퇴적물에서 생물학적 제재로써의 미생물의 가능성에 대해 연구해보았다.
인천연안은 새우 잡이 배 등 어선의 잦은 출입으로 꾸준히 원유의 노출에 대한 우려가 있어왔으며, 최근 아시아의 허브로써 늘어난 물류량을 수송하기 위해 대형화 된 선박들에 의해 그 위험성이 더 커지고 있다. 이에 crude-oil을 유일 탄소원으로 하는 배지를 이용하여 원유를 분해할 수 있는 미생물 80균주를 분리하였고, 그 중 oil film collapsing방법을 이용하여 유화능이 뛰어난 12 균주를 선별하였다. 이들 균주들에 대해 ρ-nitrophenyl butylrate를 기질로 이용하여 리파아제(lipase)활성과 n-hexanedecane을 기질로 이용하여 유화(emulsification)활성을 측정하였다. 그 중 원유 분해 활성이 뛰어난 Incheon9를 선별하고 gas chromatography (FID)로 paraffine계 탄화수소를 감소시키는 것을 확인하였다. 이 균주의 16s rRNA 유전자 분석을 통해 Acinetobacter sp.로 동정하고 NCBI에 등록하여 accession code (KF548540)를 부여 받았다. Acinetobacter sp. Incheon9의 성장과 유화능이 최적 배양 조건은 20℃, pH 7, 1% NaCl 였으며 대수 증식기 기간에 가장 높은 유화능을 보였으며 trybutyrin에서 분해능력이 탁월 한 것으로 분석되었다.
갯벌의 건강한 관리를 위해 여러 가지 방법으로 모니터링이 있어왔다. COD, TOC 등 화학적 분석 방법은 빠르고 정확한 반면, 생물이 직접적으로 받는 영향에 대한 해석이 부족한 것으로 알려져 있다. 반면, 미생물은 생태계 자가 정화를 위해 필수적인 만큼 다양한 오염원에 직접적으로 영향을 받으며, 이에 대응하기 위해 군집을 변화하는 것으로 알려져 있다. 그러나 실험실 상에서 배양 가능한 미생물은 1% 미만으로 알려져 있으며, 비배양 실험방법인 denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), temperature gradient gel electrophoresis (TGGE), terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLR)는 시퀀싱 비용적인 문제로 인해 적은 량의 데이터를 구축하는 데 적합한 것으로 알려져 왔다. 최근 분자생물학의 발전으로 인해 저비용, 고효율의 next generation sequencing 방법이 발달되었고, 이에 우리는 비배양적 실험방법인 pyrosequencing을 이용하여 강화, 옥련, 영종도 갯벌의 미생물 군집의 유전학적 자원에 대해 연구하였다. 총 16,906 유효한 유전자를 분석하였으며, 세 지역 모두 Proteobacteria, Chloroflexi, Actinobacteria, and Bacteroidetes가 우점문(phylum)인 것으로 분석되었다. UPGMA분석 결과 강화도와 옥련의 미생물 군집은 영종도의 미생물 군집보다 서로 유사했다. Simpson 우점종 지수 분석한 결과, 영종도 지역의 갯벌이 특정 미생물로 우점화 되어있는 정도가 가장 높았다. 또, Shannon 다양성 지수와 Rarefraction curve를 통해 분석해 본 결과 영종도의 미생물 군입이 다양성이 세 지역 중 가장 낮았으며, 강화도의 미생물 군집이 세 지역 중 가장 높은 것으로 분석되었다. 이 세지역의 동일 샘플로 지화학적 분석 등을 분석한 이전 연구에 의하면 3지역 모두 COD, TOC에서 비슷한 수준으로 청정한 것으로 발표되었다. 그 중 옥련의 AVS값이 (강화도, 영종도 ; 0.04 ± 0.01/g, 옥련; 0.06 ± 0.02) 다른 지역 보다 비교적 높은 것으로 분석되었는데 이는 혐기성 황환원 미생물인 Desulfobacterales와 다양한 황산화 미생물인 Epsilonproteobacteria가 다른 지역보다 옥련이 풍부한 것과 연관성이 있을 것으로 사료된다. 그러나 AVS값이 낮았던 영종도에서 혐기성 상태에서 황을 전자수용체로 이용할 수 있는 Desulfuromonadales가 높은 것은 기존 연구와 상반된 것으로 이에 대한 연구는 지속적인 유전학적 데이터 분석이 필요한 것으로 사료된다. 미생물학적 분석과 화학적 분석이 동일한 경향을 나타내기도 하지만, 다른 경향을 나타내는 것으로 보다 갯벌 생태계의 건강성을 평가 할 때 지화학적 분석과 함께 미생물 군집에 대한 분석을 함께 한다면 좀 더 포괄적으로 다양한 시작으로 갯벌을 관리 할 수 있을 것으로 사료된다.
갯벌에서 분리한 미생물이 생물자원으로 실제 활용 가능성에 대해 연구하기 위해 실제 갯벌과 유사한 갯벌 microcosm 반응기를 pilot scale로 실험실 상에서 구축하였다. 우선 세포 외 효소 (아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제, 프로테아제)를 생성하는 세균 135균주를 선별하였다. 기질을 분해해 생성물을 생산하는 정도를 흡광도법으로 측정하여 효율이 좋은 균주을 선택하고 16s rRNA유전자 분석을 통해 Pseudoalteromonas sp. IC35 (accession number: KE804087)로 명명하였다. 또, 무기황(S0)을 에너지 원으로 하여 최소배지에서 생존 가능한 황산화 세균을 31균주를 순수 분리하고 13균주를 선별한 후 sulfate ion을 측정하여 황산화능력이 뛰어난 세균을 16s rRNA 분석한 결과 Halothiobacillus neapolitanus IC_S22 (accession number: KE804088)로 명명하였다. microcosm은 총 4대를 구축하였으며, 유기물 분해 균주(대조군 M1, 접종군 M2)와 황산화 균주(대조군 M3, 접종군 M4)로 구성하였다. 이때 유기물 분해 균주의 대조군과 접종군의 COD 초기값은 320 ㎎/ℓ에서 대조군 M1이 21 ㎎/ℓ, 접종군 M2가 7 ㎎/ℓ로 접종해준 Pseudoalteromonas sp. IC35에 의해 유기물 분해 효율이 증가되었으며 real time PCR을 이용하여 microcosm 반응기 내에서 세균의 생물량도 증가됨을 확인하였다. Sulfate ion은 초기값 660 ㎎/ℓ에서 대조군 M1의 최고값이 1360 ㎎/ℓ, 접종군 M2의 최고값이 1600 ㎎/ℓ로 접종군 H. neapolitanus IC_S22에 의해 환원성 황(S0)을 산화하는 능력이 상승되었으며 real time PCR을 이용하여 pilot 내에서 세균의 생물량이 증가함에 따라 초기 sulfate ion의 양도 증가되었다. 대조군(M1, M3)에서도 지속적으로 유기물 감소와 황의 산화가 일어나는 것으로 관찰되었으나 분리한 세균을 접종한 접종군에서 그 활성도가 증가되며 접종 세균에 의한 정화작용은 접종 초기에 대부분 일어나는 것으로 관찰되었다. 접종한 세균의 생존여부를 추적하기 위해 real time PCR을 수행한 결과 접종 후 세균의 생존력은 많이 줄어들지만 지속적인 주입은 생물량을 증가 시켰다. Sulfate ion의 값이 감소하는 것은 갯벌 내에서 세균의 기질로 사용되는 무기 황의 농도가 Ks 값 이하로 감소하였기 때문으로 사료된다. 이상의 결과에서 갯벌에서는 기존의 세균 군집의 생태적인 기능에 의해 유기물이 분해되며 황이 산화되고 있지만 대사활성이 좋은 세균을 부가적으로 배양하여 접종함으로서 그 활성이 생물량에 비례하여 증가할 것으로 사료된다.
생물학적 자원으로 활용 가능한 미생물 자원의 가능성에 대해 연구한 것으로 배양 가능한 생물학적 자원을 분리하였고, 비배양 미생물을 생물학적 자원으로써 활용 가능성도 탐색해보았다. 또, 실제 갯벌 환경과 유사한 환경을 조성하여 갯벌에서 분리한 미생물을 추후 갯벌에 적용하였을 때 활성여부를 검증해보았다. 이번 연구는 갯벌 미생물을 생물학적 자원으로 활용하고자한 총괄적인 연구라 할 수 있다.

Tidal flats play significant ecological roles, such as providing habitats and nutrient cycling for marine life. The indigenous microorganisms play important roles in the biodegradation process; hence, they are a bioresource used for reducing the environmental pollution. At first, we isolated 80 culturable bacteria for use as a hydrocarbon-degradable bioresource. Among them, 12 strains were selected through the oil film collapsing method. Acinetobacter sp. Incheon 9 (NCBI accession code: KF54854) was selected based on its relatively high activity of lipase and emulsification. The optimum conditions for growth and emulsification activity for Acinetobacter sp. Incheon 9 were: temperature 20 °C, pH 7, and 1% added NaCl. Maximal production of biosurfactants peaked at 72 hours, which is the log-growth phase of Acinetobacter sp. Incheon 9. The residual oils of the cultured medium were measured by gas chromatography (FID) to verify the oil degrading ability of Acinetobacter sp. Incheon 9.
The microbial communities of the tidal flats play vital ecological roles through self-purification. Therefore, the microbial ecology of the sediment undergoes various changes due to environmental pollutants. To asses this, we used pyrosequencing technology to investigate the microbial communities of three different tidal flats (Ganghwa Island, Ongnyeon, and Yeongjong Island). A total of 16,906 sequences were obtained. We used these sequences to identify the dominant phyla in the three tidal flats: Proteobacteria, Chloroflexi, Actinobacteria, and Bacteroidetes. The composition of the bacterial community of Ganghwa Island and Ongnyeon were similar to each other. The Simpson’s dominance index of Yeongjong Island was higher than that of other regions and the Shannon diversity index of this region was the lowest among them. Previous research on these same tidal flats sites showed that these three regions have similar geochemical characteristics through COD, AVS, and TOC measurements. However, our study proved that the bacterial communities were distinct. Perhaps this is because analysis of microbial communities is more sensitive and complex than physiochemical analysis. For comprehensive management of tidal flats, the pyrosequencing of bacterial communities is recommended to be used in tandem, as an effective monitoring tool.
Finally, we assessed the bioremediation efficiency of tidal flat soil using microcosm reactors. Two bacterial strains selected from the tidal flat soil were introduced to the microcosm reactors. These reactors were specially designed to functionally mimic the tidal ecological conditions. We screened 1089 bacterial strains that were producing extracellular enzymes. Among them, Pseudoalteromonas sp. IC35 was selected based on the relatively high activity of specific enzymes (amylase, cellulose, lipase, and protease). The sulfated oxidation bacteria, H. neapolitanus IC_S22 was chosen through selective medium and absorbance and further identified through 16S rRNA gene sequencing.
This research was undertaken in the hopes of improving and advancing eco-friendly environment remediation by microorganisms.