둥글장수풍뎅이와 흰점박이꽃무지 유충의 세포성면역 분석 :Cellular responses in Larvae of Pentodon quadridens bidentulus(Famaire, 1887) and protaetia bravitarsis seulensis

황두선

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자료유형: 학위논문

저자정보: 황두선 (강원대학교, 강원대학교 일반대학원)

지도교수: 조세열

발행연도: 2018

저작권: 강원대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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2018

둥글장수풍뎅이와 흰점박이꽃무지 유충의 세포성면역 분석

황두선 응용생물학과 2018.01 학위논문

흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유충에서 병원균과 공생균 분비물질들에 의한 세포성면역반응

황두선 , 조세열 한국응용곤충학회지 2018.01 학술저널

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본 연구는 둥글장수풍뎅이(Pentodon quadridens bidentulus(Famaire, 1887))유충의 혈림프에 존재하는 혈구세포들의 종류와 병원균 침입시 세포 면역을 담당하는 세포를 특정하고 분석하였다. 둥글장수풍뎅이 유충의 혈강내에는 과립혈구세포, 부정형혈구세포, 편도혈구세포, 소구형혈구세포, 원시혈구세포, 지방혈구세포 총 6가지의 혈구세포들이 존재하였다. 혈구세포 중 둥글장수풍뎅이 유충의 주요한 면역세포를 알아보기 위해 라텍스 비드와 대장균을 주입하여 혈구세포의 형태적 변화를 측정하였고, 과립혈구세포의 위족과 트랩이 발달되는 변화를 관찰할 수 있었다. 외래물질을 주입한 둥글장수풍뎅이 유충의 리소좀 활성을 확인하기위해 LysoTracker-Red로 염색한 결과 과립혈구세포에서 리소좀 활성이 대조군에 비해 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 생체내에서 병원균 침입시 12시간안에 활발히 식균작용을 수행하였고 24시간 이후로는 면역 활성화가 줄어들면서 정상상태로 전환되는 것을 알 수 있었다. 세포질 혈구세포의 식균작용도 간혹 관찰되었으나 나머지 세포들은 면역과 연관된 활성화가 없는 것으로 나타났다. 또한 미생물들이 곤충 체내에 침입한 후 분비하는 다양한 대사물질에 의하여 곤충의 면역반응이 시작되는지 알아보기위해 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유충의 장내에 존재하는 장내 미생물과 병원균을 동일한 조건에서 배양하고 다양한 대사물질들이 존재할 것이라고 예상되는 병원균 배양액만을 유충에 주사하여 면역반응여부를 조사하였다. 장내 미생물 배양액을 주입한 유충들은 비교적 건강하고 면역반응도 발생하지 않았으나 병원균 배양액을 주입한 유충의 경우 150시간 후 60%이상의 유충이 사망하였고 배양액이 주입된 부위도 짙은 갈색의 멜라닌화(melanization)가 관찰되었다. 이러한 면역반응은 과립혈구세포의 리소좀 활성화 여부로 재확인하였는데 병원균 배양액이 주입된 유충들의 경우 12시간 후 리소좀이 ∼50% 이상 활성화 되었으나 장내 미생물 배양액이 주입된 유충들의 경우 ∼5% 미만으로 활성화되는 것으로 나타났다. 따라서 장내 미생물 배양액내에는 기주면역반응을 유도하는 물질들이 없거나 매우 적은 양이 존재하는 것을 추측할 수 있었다.

The purpose of this study was analyze the characterization of hemocytes in the hemolymph of the larvae of Pentodon quadridens bidentulus and the characterization of the hemocytes responsible for cellular immunity during pathogen infection. Granulocytes, plasmatocytes, oenocytoids, spherulocytes, prohemocytes and adipohemocytes were found in the circulating hemocytes. The morphological changes of hemocytes were observed by injecting latex beads and E.coli K-12 to examine the major immune cells of the larvae of P.quadridens bidentulus. To confirm lysosomal activity of P.quadridens bidentulus larvae injected with foreign substances, lysotracker staining showed that lysosomal activity was increased in granulocyte cells compared to the control. In particular, it was observed that the most active phagocytic action occurred within 12 hours in vivo, and that after 24 hours, the immune activation was reduced and converted to a normal state. Plasmatocytes were occasionally observed as immunological response, but the remaining hemocytes were not related to immunological activation. In addition to examined the immune response to various metabolites produced by microorganisms after they enter the host. Here, we examined immune responses in Protaetia brevitarsis seulensis larvae induced by metabolites produced by symbiotic and pathogenic bacteria. The two types of bacteria were cultured under the same conditions. The bacteria were then removed and the remaining culture supernatant was injected into the larvae. The larvae injected with culture medium (Ch-medium) from symbiotic bacteria remained relatively healthy and did not develop an immune response, whereas more than 60% of the larvae injected with pathogen culture medium (Ec-medium) died after 150 hours and dark brown patches of melanin were observed at the injection site. This immune response was confirmed by the finding of activated lysosomes in insect granulocytes. More than 50% of lysosomes in larvae injected with pathogen culture medium were strongly stained after 12 h, but less than 5% of those injected with symbiotic culture media were stained. Therefore, it is assumed that intestinal bacteria produce few (if any) substances that induce host immune responses.

#둥글장수풍뎅이 #면역 #혈림프 #과립혈구세포 #식균작용 #미생물 배양액 #대사물질 #흰점박이꽃무지

Ⅰ. 서 론.............................................................................................................................
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Ⅱ. 재료 및 방법....................................................................................................................
4
1. 곤충사육........................................................................................................................
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2. 혈림프 및 혈구세포 분리.........................................................................................
3. 흰점박이꽃무지 유충의 장내 미생물 분리 및 배양..........................................
4. 둥글장수풍뎅이와 흰점박이꽃무지 유충에 외래물질과 배양액 주입...........
5. 혈구세포 염색.............................................................................................................
6. 현미경 관찰, Flow cytometry(FACs)분석, 생존율 조사................................
4
5
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6
6
Ⅲ. 결 과.............................................................................................................................
7
1. 둥글장수풍뎅이 유충의 혈구세포 분류................................................................
2. 외래물질 주입에 따른 혈구세포의 면역학적 형태변화...................................
3. 라텍스 비드 주입에 따른 과립혈구세포내 과립 형성과 축적....................... 4. 대장균 주입에 따른 LysoTracker-Red 염색을 통한 유세포분석................
5. 미생물 배양액 주입과 흰점박이꽃무지 유충의 생존율...................................
6. 미생물 배양액 주입에 따른 혈구세포 리소좀 활성화.....................................
7. 미생물 배양액 주입에 따른 유세포분석..............................................................
7
10
12
14
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20
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Ⅳ. 고 찰............................................................................................................................
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Ⅴ. 참고문헌............................................................................................................................
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