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논문 기본 정보

자료유형
학위논문
저자정보

김종석 (강원대학교, 강원대학교 일반대학원)

지도교수
하석진
발행연도
2018
저작권
강원대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수84

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이 논문의 연구 히스토리 (2)

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다발성경화증은 중추 신경계 및 신경 퇴행에 영향을 미치는 자가면역 질환이며 정확한 질병 원인이 밝혀져 있지 않은 난치병으로 전 세계적으로 발병 환자는 약 250만명으로 추정된다. 대부분 서양인에게서 많이 발병하며 국내의 경우 발병률이 낮아 희귀병에 속한다. 일반적으로 다발성경화증 치료제로 인간 인터페론 베타가 사용되지만, 국내에서는 치료제의 수입량이 제한되어 있다. 때문에, 가격이 높아 환자가 제대로 된 의료 혜택을 받지 못하고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 고가 희귀치료제를 대처할 약품 개발에 힘써 많은 환자들의 치료기회 증진이 필요하다.
본 연구에서는 다발성경화증 치료제로 많이 쓰이는 인간 인터페론 베타를 대장균을 이용해 대량 생산하기 위하여 코돈이 최적화된 유전자를 합성하여 pQE-30 벡터에서 벡터 시스템을 개발 하였다. 또한, 인터페론 베타 생산을 증가시키기 위하여 온도, 초기 O.D, induction 시간, IPTG 농도 조건 최적화를 위한 연구를 수행하였다. 최적화 결과 온도 20℃, 초기 O.D=0.7(A600nm), induction 시간 12시간, IPTG 농도 0.2 mM 조건에서 가장 높은 인터페론 베타 생산을 확인하였다. 대량 생산을 위하여 15℃ 또는 20℃ 조건에서 130 rpm으로 교반하며 발효기를 이용한 배양을 수행하여 flask 보다 많은 인터페론 베타가 발현되는 것을 확인하였다. 하지만 발현된 인터페론 베타가 soluble 형태가 아닌 insoluble한 형태로 발현되는 것을 확인하였다.
Insoluble한 형태의 인터페론 베타를 soluble한 형태로 변환하기 위하여 urea 및 zwittergent 3-14 버퍼를 사용하여 solubilization 최적화 실험을 수행하였다. Urea solubilization 버퍼를 사용하여 시간이 지남에 따라 soluble한 인터페론 베타가 insoluble 형태로 변환되어 침전되는 것을 확인하였다. 반면에 zwittergent 3-14 solubilization 버퍼를 사용하여 soluble 형태로 효과적으로 변환되는 것을 확인하였다. 추가로 soluble 형태의 단백질 발현 증가를 위하여 pH 조건을 최적화하는 실험을 수행하였다.

목차

List of Tables --------------------------------------------------------- v
List of Figures -------------------------------------------------------- vi
Ⅰ. 서론 ------------------------------------------------------------- 1
1. 1. 다발성경화증이란? ---------------------------------------- 1
1. 2. 다발성경화증의 증상 및 치료 ---------------------------- 3
1. 3. 인터페론 베타 생산 방법 --------------------------------- 6
Ⅱ. 재료 및 방법 ---------------------------------------------------- 8
2. 1. 재료 -------------------------------------------------------- 8
2. 2. 단백질 발현 조건 최적화 --------------------------------- 9
2. 2. 1. 온도 조건 ----------------------------------------- 9
2. 2. 2. 초기 O.D ------------------------------------------ 9
2. 2. 3. Induction 시간 ----------------------------------- 10
2. 2. 4. IPTG 농도 ---------------------------------------- 10
2. 3. Scale up --------------------------------------------------- 11
2. 4. Solubilization 및 refolding ------------------------------ 12
2. 4. 1. Urea를 사용한 solubilization -------------------- 12
2. 4. 2. Zwittergent 3-14를 사용한 solubilization ----- 13
2. 5. SDS-PAGE ----------------------------------------------- 15
Ⅲ. 결과 및 고찰----------------------------------------------------- 16
3. 1. 사전 실험 요약 ------------------------------------------- 16
3. 2. 단백질 발현 조건 최적화 -------------------------------- 17
3. 2. 1. 온도 조건 최적화 --------------------------------- 17
3. 2. 2. 초기 O.D 조건 최적화 --------------------------- 19
3. 2. 3. Induction 시간 조건 최적화 --------------------- 21
3. 2. 4. IPTG 농도 조건 최적화 -------------------------- 23
3. 3. Scale up을 위한 발효기 사용 ---------------------------- 27
3. 4. Solubilization 및 refolding ------------------------------ 30
3. 4. 1. Urea를 사용한 solubilization ------------------- 30
3. 4. 2. Urea solubilization 조건 최적화 ---------------- 33
3. 4. 3. Zwittergent 3-14를 사용한 solubilization ---- 36
3. 4. 4. Zwittergent 3-14 solubilization 조건 최적화 - 39
Ⅳ. 결론 -------------------------------------------------------------- 42
참고문헌 --------------------------------------------------------------- 44
Abstract --------------------------------------------------------------- 49

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