혼효림과 일본잎갈나무림으로부터 목질바이오매스 분해 박테리아 분리 :

박화랑

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자료유형: 학위논문

저자정보: 박화랑 (경남과학기술대학교, 경남과학기술대학교 대학원)

지도교수: 김봉규

발행연도: 2017

저작권: 경남과학기술대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수3

이 논문의 연구 히스토리 (2)

2018

혼효림으로부터 셀룰로오스분해 박테리아 분리 및 효소학적 특성규명

박화랑 , 오기철 , 김봉규 Journal of applied biological chemistry 2018.01 학술저널

2017

혼효림과 일본잎갈나무림으로부터 목질바이오매스 분해 박테리아 분리

박화랑 산림자원학과 2017.01 학위논문

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지구상에서 가장 풍부한 유기물은 목질바이오매스이다. 목질바이오매스는 주로 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌 등과 같은 구성 물질로 이루어져 있다. 특히 셀룰로오스, 헤미셀룰로스 등은 다당류 분해 효소(cellulase, xylanase, β-glucosidase, β-xylosidase)에 의해 다양한 생물들이 사용할 수 있는 단당류로 분해된다. 특히, 다량의 바이오매스가 생산되는 산림은 다양한 종류의 목재부후균, 섬유소 분해 박테리아 등과 같은 미생물들이 중요한 역할을 담당하고 있다. 이들에 의해 분해된 목질바이오매스는 토양의 비옥도를 증진시킬 뿐만 아니라 다양한 생물들의 에너지원으로 공급되어 건전한 산림내의 생태계를 유지하는데 중요한 역할을 한다.
본 연구는 경상남도 산청군에 위치한 경남과학기술대학교 학술림 내 고동재 부근의 혼효림과, 낙엽송림을 대상으로 LB-CMC agar plate 이용하여 배양 가능한 박테리아의 밀도와 CMCase와 xylanase를 생산하는 3개의 미생물을 분리하였다. API kit 분석 및 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에 근거하여 분리한 3개의 박테리아들은 모두 Bacillus 종에 속하는 것으로 동정되었으며, Bacillus sp. EFL1, Bacillus sp. EFL2, Bacillus sp. EFP3로 명명하였다. Bacillus sp. EFL1의 최적의 생장온도는 37℃이었고, CMCase의 효소활성은 배양 후 24시간에 최고에 도달하였으며, xylanase의 효소활성은 배양 후 12시간에 최고에 도달하였다. Bacillus sp. EFL1이 생산하는 CMCase 효소활성의 최적온도는 50℃, pH는 5.0∼7.0이었고, xylanase 효소활성의 최적온도는 50℃, pH 6.0이었다. CMCase와 xylanase는 온도에 대해 불안정한 경향을 보였다. Bacillus sp. EFL2의 최적의 생장온도는 37℃였고, CMCase의 효소활성은 배양 후 24시간에 최고에 도달하였고, xylanase의 효소활성은 배양 후 36시간에 최고에 도달하였다. Bacillus sp. EFL2가 생산하는 CMCase 효소활성의 최적온도는 70℃, pH는 5.0이었고, xylanase 효소활성의 최적온도는 70℃였고, pH 3.0∼9.0까지 비교적 안정적이었다. CMCase의 경우 온도에 대한 안정성이 높지 않았지만, xylanase의 경우 온도안정성이 높은 것을 보였다. Bacillus sp. EFP3의 최적의 생장온도는 37℃였고, CMCase의 효소활성은 배양 후 12시간에 최고에 도달하였고, xylanase의 효소활성은 배양 후 8시간에 최고에 도달하였다. Bacillus sp. EFP3가 생산하는 CMCase 효소활성의 최적온도는 50℃, pH는 5.0이었고, xylanase 효소활성의 최적온도는 50℃, pH 4.0이었다. CMCase와 xylanase 모두 온도안정성이 낮은 경향을 보였다.

The most abundant organic material on earth is lignocellulosic biomass. The lignocellulosic biomass is mainly composed of materials such as cellulose, hemicellulose, and lignin. In particular, cellulose and hemicellulose are degraded into monosaccharides by polysaccharide degrading enzymes (cellulase, xylanase, β-glucosidase, β-xylosidase) that can be used by various organisms. Because forests produce large amounts of biomass, microbes such as various kinds of wood rot fungi and cellulolytic bacteria play an important roles in forest. The lignocellulosic biomass degraded by them plays an important role not only in enhancing fertility of the forest soil but also as an energy source for a variety of organisms to maintain a healthy forest.
This study was conducted to isolate the cellulolytic bacteria on the mixed forest and Larix leptolepis stands near Godongae (hill) in the Gyeongnam National University of Science and Technology (GNTECH) forest located in Sancheong-gun, Gyeongsangnam-do. LB-CMC agar plate was used to determine the number of culturable bacteria and screen for cellulolytic bacteria. As a result, the number of culturalble bacteria was higher in the soil of mixed forest site (6.8 × 107 CFU/g soil) than that in the soil of Larix leptolepis site with 2.1 × 106 CFU/g soil. The cellulolytic bacteria in the mixture forest were approximately 5.1 × 107 CFU/g soil, which accounts of 75% of the total culturable bacteria. On the other hand, the cellulolytic bacteria from the soil of Larix leptolepis site were 2.1 × 106 CFU/g soil, which accounts of 20% of the total culturable bacteria. Among the cellulolytic bacteria, three bacteria with high activity on the CMC and xylan were isolated. To identify the isolated bacteria, API kit and 16S rRNA sequencing analysis were used. The bacteria isolated from the forest soil were found to belong to the genus Bacillus. Based on this evidence, I named the bacteria such as Bacillus sp. EFL1, Bacillus sp. EFL2, and Bacillus sp. EFP3. The optimal growth of Bacillus sp. EFL1, Bacillus sp. EFL2, and Bacillus sp. EFP3 were 37℃. The maximal activity of Bacillus sp. EFL1 CMCase was 24 hour after culture, whereas the maximal activity of xylanase was 12 hour after culture. The optimal temperature and pH of CMCase from Bacillus sp. EFL1 were 50℃ and 5.0∼7.0, respectively, but the optimal temperature and pH of xylanase were 50℃, pH 6.0, respectively. Both activities of CMCase and xylanase from Bacillus sp. EFL1 showed to be thermally unstable.
The maximal activity of Bacillus sp. EFL2 CMCase was 24 hour after culture, whereas the maximal activity of xylanase was 36 hour after culture. The optimal temperature and pH of CMCase from Bacillus sp. EFL1 were 70℃ and 5.0, respectively, but the optimal temperature and pH of xylanase were 70℃. Especially, the xylanase from Bacillus sp. EFL2 showed high activity at all pHs tested.
Although the CMCase from Bacillus sp. EFL2 showed to be thermally unstable, xylanase from Bacillus sp. EFL2 showed to be thermally stable at 40℃, 50℃, and 70℃. The maximal activity of the CMCase from Bacillus sp. EFP3 was 12 hour after culture, whereas the maximal activity of xylanase was 8 hour after culture. The optimal temperature and pH of CMCase from Bacillus sp. EFP3 were 50℃ and 5.0, respectively, but the optimal temperature and pH of xylanase were 50℃, pH 4.0, respectively. Both activities of CMCase and xylanase from Bacillus sp. EFP3 showed to be thermally unstable.

*A thesis submitted to the Committee of the Graduate School, Gyeongnam National University of Science and Technology in partial fulfillment of the requirements for degree of Master of Agriculture in August 2017

목 차
List of tables ⅲ
List of figures ⅳ
Ⅰ. 서 론 1
Ⅱ. 재료 및 방법 4
1. 산림토양으로부터 당화 박테리아 분리 4
2. 순수 분리된 당화 미생물의 동정 5
3. 분리된 당화 미생물의 효소활성 측정 7
Ⅲ. 결과 및 고찰 8
1. 산림토양으로부터 배양 가능한 박테리아 및 목질바이오매스 분해 미생물의 비율 8
2. 목질바이오매스 분해 미생물의 분리 및 Vitek을 이용한 균 동정 12
3. 16S rRNA를 이용한 균의 동정 17
4. 박테리아 게놈의 목질바이오매스 분해 유전자 분석 23
5. 목질바이오매스 분해 미생물의 생장특성 37
6. CMCase와 Xylanase의 최적 온도 및 pH 42
7. CMCase와 Xylanase의 온도안정성 48
Ⅳ. 결론 53
참고문헌 55
국문초록 61
영문초록 63
감사의 글 66

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