본 연구에서는 개화 기간이 긴 Phalaenopsis ‘KS Little Gem’의 전사체 및 유전체를 조립, 분석하고 품종구분과 보호를 위한 엽록체 유전자 및 conserved ortholog set (COS) 기반 분자표지를 개발하였다. 조립된 전사체는 총 길이 82.3 Mb로 unigene 101,975개를 포함하고 있으며 이중 71,327개의 주석을 결정하였다. 엽록체 유전체는 총 길이 148,918 bp로써 유전자 104개를 포함하고 있었다. 핵 유전체는 총 길이 3.0 Gb로 조립되었으며 이는 예측한 크기(4.5 Gb)의 66.4%에 해당한다. 핵 유전체에 암호화된 유전자는 49,482개로 예측되었으며 이 중 주석이 결정된 유전자는 39,104였다. 조립한 전사체, 엽록체 유전체, 핵 유전체를 사용하여 호접란 품종구분 분자표지를 개발하였다. P. ‘KS Little Gem’ 구분 분자표지는 2가지 방식으로 개발하였다. 첫 번째 종류는 엽록체 유전자 rpl16의 인트론으로부터 개발되었으며, 그 크기는 251 bp였고, 다른 난초과 식물 사이에서 다양한 크기의 다형성이 나타났다. 두 번째 종류는 단자엽 식물의 COS 유전자의 인트론으로부터 개발하였다. 먼저 벼(Oryza sativa)와 바나나(Musa acuminata), 그리고 P. equestris 유전체의 단백질 서열을 사용하여 보존된 단자엽 COS 유전자 672개를 찾고, 이 유전자들의 P. equestris nucleotide 서열과 암호화 서열을 P. ‘KS Little Gem’의 unigene 서열과 비교분석하여 최종적으로 3개의 COS 분자표지를 선발하였다. 3개의 COS 분자표지가 표적 하는 유전자의 P. equestris 서열을 사용해 Blast2GO 분석을 수행한 결과 COS001은 rRNA 소단위체를 메틸화하는 효소를 생산하는 유전자로 예측되었고, COS002는 아직 밝혀지지 않은 단백질을 생산하는 유전자로 세포막으로 둘러싸인 소포에서 phosphatidylinositol을 생산하거나 광주기성 또는 개화에 관련된 기능을 하는 것으로 예측되었으며, COS003은 DNA repair helicase xpb1 enzyme을 생산하는 유전자로 예측되었다. 분자표지의 평가는 P. ‘KS Little Gem’을 포함한 호접란 19종을 사용하여 실시하였다. COS001은 P. ‘KS Little Gem’에서 387 bp와 520 bp 두 가지 크기로 예측되었으며 PCR 결과 두 밴드 모두가 증폭되었으나 다른 종에서는 두 밴드 중 한 밴드만 증폭되었다. COS002는 P. ‘KS Little Gem’에서 200 bp와, 224 bp 크기로 예측되었고 PCR 결과 두 밴드 모두 증폭되었으며 다른 종에서는 두 밴드 중 한 밴드만 증폭되었다. COS003은 P. ‘KS Little Gem’에서 525 bp와, 621 bp, 675 bp 크기로 예측되었으나 PCR 결과 621 bp와 675 bp 크기의 밴드만 증폭되었고 다른 종에서는 다양한 크기의 밴드가 증폭되었다. 따라서 엽록체 분자표지 1종과 COS 분자표지 3종을 조합하면 P. ‘KS Little Gem’을 다른 종의 Phalaenopsis 사이에서 구분하는 것이 가능하며, 다양한 Phalaenopsis 속 및 종간 잡종 품종구분에도 적용이 가능할 것이다. 본 연구에서 사용한 분자표지 개발 전략은 유전체 조립이 염색체 수준에 미치지 못하는 scaffold 수준으로 완성되어있는 종 사이에서도 효과적으로 사용 가능하다.

Gene-based markers are useful tools for genetic background survey and comparative genome analysis due to their easy application across closely-related species. We developed gene-based DNA markers for Phalaenopsis ‘KS Little Gem’, a new Phalaenopsis variety with excellent ornamental traits, based on a genome-wide comparison of chloroplast and nuclear sequences with those of orchids as well as monocot species, including rice and banana, to establish a molecular basis for species identification. Sequence comparisons of the chloroplast DNA of P. ‘KS Little Gem’ with those of P. aphrodite and P. equestris identified six variable genic regions of the chloroplast genome in which an intron of rpl16 was the most polymorphic between relative orchid species. To develop conserved ortholog set (COS) markers, we compared transcriptome unigenes of P. ‘KS Little Gem’ with P. equestris, rice, and banana genomes and identified 582 Phalaenopsis COS candidates with at least two exons. PCR application with primer sets targeting six variable regions in the chloroplast genome and introns of 45 randomly selected COS candidate genes showed 92-98% amplification in three Phalaenopsis species. Among the candidate genes, we developed rpl16 and three COS genes as diagnostic cross-species markers for P. ‘KS Little Gem’ and diverse related orchids. The gene-based molecular markers developed in this study will play an important role in species identification in protecting variety right, breeding, and genetic studies of Phalaenopsis orchids.