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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 유용만
- 발행연도
- 2016
- 저작권
- 충남대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수1
이 논문의 연구 히스토리 (10)
2016
2009
Bacillus thuringiensis. subsp. kurstaki CAB141 균주와 Tannic acid의 상호작용
진나영
,
김태환
,
박찬
외 5명
한국응용곤충학회 심포지엄
2009.10
학술대회자료
Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki CAB 141 균주와 Tannic acid의 혼합처리에 의한 상승효과
진나영
,
김태환
,
박찬
외 5명
한국농약과학회 학술발표대회 논문집
2009.10
학술대회자료
Tannic acid와 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki KB100균주의 혼합처리에 의한 파밤나방 살충활성의 상승효과
진나영
,
정선영
,
박찬
외 4명
한국응용곤충학회지
2009.01
학술저널
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새로운 Bacillus thuringiensis 균주를 분리 동정 하였으며, 살충활성을 높이기 위해 protease inhibitor인 tannic acid를 선발하여 혼합처리 하여 상승효과를 나타냈고 이에 따른 원인을 구명하고자 다양한 실험을 통해 다음과 같은 결과를 얻었다.
1. 국내의 난방제 해충으로 알려진 파밤나방을 방제하기 위하여 토양으로부터 Bacillus thuringiensis 균주를 분리 동정 하였다. B. thuringiensis subsp. kurstaki KB100 으로 동정되었으며 cry genes은 cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1D, cry1I gene을 포함하였다.
2. B. thuringiensis KB100 균주의 살충력을 강화시키기 위해 몇 개의 protease inhibitor 를 조사하였으며, 이 중 단백질 분해 억제 능력이 가장 좋은 tannic acid을 선발하였다. B. thuringiensis KB100 균주의 배양액에 tannic acid을 혼합 처리하여 파밤나방 2령 유충을 대상으로 생물활성을 조사한 결과, B. thuringiensis KB100 균주 단독처리는 54.4%의 사충률을 보인 반면 B. thuringiensis KB100 균주와 4mM tannic acid을 혼합하여 처리하면 64.0% 그리고 B. thuringiensis KB100 균주 + 40mM tannic acid는 95.5%의 높은 상승효과를 각각 나타내었다. 그러나 B. thuringiensis KB100 균주 + 80mM tannic acid에서는 53.3%로 단독처리의 경우보다 사충률이 낮게 나타났다. 3령 유충에서도 B. thuringiensis KB100 균주 단독처리는 60.0%였으며 B. thuringiensis KB100 균주 + 40mM tannic acid는 93.3%로 사충률이 증가하는 상승효과를 보였다. 야외포장 실험에서 B. thuringiensis KB100 균주 단독처리는 1회, 2회, 3 회 누적 처리에서 각각 61.8%, 80.4% 그리고 47.3%의 사충률을 나타낸 것에 비해 B. thuringiensis KB100 균주와 40mM tannic acid의 혼합 처리구에서는 83.9%, 89.4%와 66.8%로 사충률이 증가되었다.
3. B. thuringiensis KB100 균주와 40mM tannic acid와의 혼합처리 시 상승효과에 관한 원인을 구명하고자 SDS-PAGE, trypsin substrates activity assay, trypsin colorimetric activity assay, qRT-PCR 분석을 통한 trypsin gene의 발현량 분석, 면역형광항체법 실험을 실시하였다. 중장액 속에서 tannic acid의 농도차에 따 라 결정성 독소 단백질의 반응결과는 SDS-PAGE로 조사되었다. B. thuringiensis 와 tannic acid를 혼합처리 했을 때, B. thuringiensis 단독처리보다 상승효과를 나타내었다. 살충활성 검정에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 중장액 + B. thuringiensis KB100 toxin + 40mM tannic acid의 SDS-PAGE 결과, 60kDa의 살충활성 밴드가 계속해서 유지됨을 확인 하였다. 파밤나방 중장 protease의 활성에 대한 tannic acid의 억제율을 측정한 결과는, 10, 20, 40, 80mM tannic acid의 농도가 높아질수록 파밤나방 중장 protease 활성은 약 83.1%, 77.6%, 68.0%, 40.1%로 낮아짐을 확인 하였다. Protease의 종류에 따른 기질 반응 분석을 한 결과 Trypsin의 경우 단백질 분해 활성이 BApNA, BPVApNA 기질에서 각각 91.4%, 89.4%를 나타내었다. Trypsin에 tannic acid를 처리한 경우에는 단백 질 분해 활성이 BApNA, BPVApNA 기질에서 각각 62.2%, 54.5%를 나타내었다. Tannic acid에 의해 trypsin 기질은 29.2%와 34.9% 억제 됐다. Chymotrypsin과 elastase의 경우 tannic acid에 의해 단백질 분해 활성은 억제하지 않았다. Trypsin colorimetric activity assay, qRT-PCR 분석을 통한 trypsin gene의 발현량 분석, 면역형광항체법 실험 결과 B. thuringiensis KB100 균주를 파밤나방 중 장 protease가 분해 할 때 40mM tannic acid가 첨가됨에 따라 발현량 및 이미 지 분석에 있어서 차이가 있음을 확인하였다.
1. 국내의 난방제 해충으로 알려진 파밤나방을 방제하기 위하여 토양으로부터 Bacillus thuringiensis 균주를 분리 동정 하였다. B. thuringiensis subsp. kurstaki KB100 으로 동정되었으며 cry genes은 cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1D, cry1I gene을 포함하였다.
2. B. thuringiensis KB100 균주의 살충력을 강화시키기 위해 몇 개의 protease inhibitor 를 조사하였으며, 이 중 단백질 분해 억제 능력이 가장 좋은 tannic acid을 선발하였다. B. thuringiensis KB100 균주의 배양액에 tannic acid을 혼합 처리하여 파밤나방 2령 유충을 대상으로 생물활성을 조사한 결과, B. thuringiensis KB100 균주 단독처리는 54.4%의 사충률을 보인 반면 B. thuringiensis KB100 균주와 4mM tannic acid을 혼합하여 처리하면 64.0% 그리고 B. thuringiensis KB100 균주 + 40mM tannic acid는 95.5%의 높은 상승효과를 각각 나타내었다. 그러나 B. thuringiensis KB100 균주 + 80mM tannic acid에서는 53.3%로 단독처리의 경우보다 사충률이 낮게 나타났다. 3령 유충에서도 B. thuringiensis KB100 균주 단독처리는 60.0%였으며 B. thuringiensis KB100 균주 + 40mM tannic acid는 93.3%로 사충률이 증가하는 상승효과를 보였다. 야외포장 실험에서 B. thuringiensis KB100 균주 단독처리는 1회, 2회, 3 회 누적 처리에서 각각 61.8%, 80.4% 그리고 47.3%의 사충률을 나타낸 것에 비해 B. thuringiensis KB100 균주와 40mM tannic acid의 혼합 처리구에서는 83.9%, 89.4%와 66.8%로 사충률이 증가되었다.
3. B. thuringiensis KB100 균주와 40mM tannic acid와의 혼합처리 시 상승효과에 관한 원인을 구명하고자 SDS-PAGE, trypsin substrates activity assay, trypsin colorimetric activity assay, qRT-PCR 분석을 통한 trypsin gene의 발현량 분석, 면역형광항체법 실험을 실시하였다. 중장액 속에서 tannic acid의 농도차에 따 라 결정성 독소 단백질의 반응결과는 SDS-PAGE로 조사되었다. B. thuringiensis 와 tannic acid를 혼합처리 했을 때, B. thuringiensis 단독처리보다 상승효과를 나타내었다. 살충활성 검정에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 중장액 + B. thuringiensis KB100 toxin + 40mM tannic acid의 SDS-PAGE 결과, 60kDa의 살충활성 밴드가 계속해서 유지됨을 확인 하였다. 파밤나방 중장 protease의 활성에 대한 tannic acid의 억제율을 측정한 결과는, 10, 20, 40, 80mM tannic acid의 농도가 높아질수록 파밤나방 중장 protease 활성은 약 83.1%, 77.6%, 68.0%, 40.1%로 낮아짐을 확인 하였다. Protease의 종류에 따른 기질 반응 분석을 한 결과 Trypsin의 경우 단백질 분해 활성이 BApNA, BPVApNA 기질에서 각각 91.4%, 89.4%를 나타내었다. Trypsin에 tannic acid를 처리한 경우에는 단백 질 분해 활성이 BApNA, BPVApNA 기질에서 각각 62.2%, 54.5%를 나타내었다. Tannic acid에 의해 trypsin 기질은 29.2%와 34.9% 억제 됐다. Chymotrypsin과 elastase의 경우 tannic acid에 의해 단백질 분해 활성은 억제하지 않았다. Trypsin colorimetric activity assay, qRT-PCR 분석을 통한 trypsin gene의 발현량 분석, 면역형광항체법 실험 결과 B. thuringiensis KB100 균주를 파밤나방 중 장 protease가 분해 할 때 40mM tannic acid가 첨가됨에 따라 발현량 및 이미 지 분석에 있어서 차이가 있음을 확인하였다.
목차
서 론 1제 1 장. 파밤나방에 활성있는 B. thuringiensis subsp. kurstaki KB100 균주의 특성 61. 재료 및 방법 81) 토양시료 채취 82) B. thuringiensis 균주의 분리 및 동정 83) B. thuringiensis 균주의 형태 관찰 9① 위상차현미경 9② 주사전자현미경 94) 실험곤충 95) 생물활성검정 10① P. xylostella에 대한 독성 검정 10② S. litura 와 S. exigua에 대한 독성 검정 10③ C. pipiens molestus, C. pipiens pallens, A. aegypti에 대한 독성 검정 11④ 반수치사농도(LC50) 116) Parasporal inclusions 준비 117) S. exigua 중장액 준비 118) SDS-PAGE 분석 129) Plasmid DNA 추출 1210) PCR 분석 1311) Western blotting 분석 182. 결과 및 고찰 191) B. thuringiensis의 분리 및 동정 192) 생물활성검정 203) B. thuringiensis subsp. kurstaki KB100 균주의 형태적 특성 224) SDS-PAGE 분석 235) B. thuringiensis subsp. kurstaki KB100 균주의 Cry genes 분석 266) B. thuringiensis subsp. kurstaki KB100 균주의 Western blotting 분석 31제 2 장. Tannic acid와 B. thuringiensis subsp. kurstaki KB100 균주의 혼합처리 시 파밤나방 살충활성의 상승효과 331. 재료 및 방법 351) B. thuringiensis 균주와 Protease inhibitor 준비 352) 생물활성검정 35① 실내생물검정 36② 섭식저해실험 36③ 야외포장실험 36④ 반수치사농도(LC50) 및 사충률 분석 363) SDS-PAGE 분석 372. 결과 및 고찰 381) 파밤나방 중장액에 대한 Protease inhibitor의 저해효과 382) 파밤나방에 살충활성이 있는 B. thuringiensis 균주에 대한 Tannic acid와의 상승효과 확인 423) B. thuringiensis subsp. kurstaki KB100 균주와 Tannic acid의 혼합 처리에 의한 파밤나방의 살충효과 454) B. thuringiensis subsp. kurstaki KB100 균주와 Tannic acid의 혼합 처리시 파밤나방의 생장율 효과 및 용화율 535) 파포장에서의 혼합처리 효과 576) 파밤나방에 활성 있는 B. thuringiensis 균주와 다양한 Protease inhibitor와의 혼합처리 시 상승효과 607) 다양한 나비목 해충에 대한 B. thuringiensis subsp. kurstaki KB100 균주와 Tannic acid의 혼합에 따른 살충효과 65제 3 장. Tannic acid와 B. thuringiensis subsp. kurstaki KB100 균주의 혼합처리 시 상승효과의 원인 구명 671. 재료 및 방법 681) Parasporal crystal, Tannic acid와 Trypsin, Chymotrypsin 준비 682) SDS-PAGE 분석 683) 파밤나방 Proteases의 Zymogram 분석 694) 파밤나방의 Proteases 활성 측정 695) Trypsin activity 분석 706) 파밤나방의 Total RNA 추출 및 cDNA 합성 727) 파밤나방의 Trypsin gene 서열 확인 및 qRT-PCR 분석 748) 면역형광항체법(Immunofluorescence) 및 Confocal laser scanning microscope 762. 결과 및 고찰 771) 파밤나방 중장액과 Tannic acid에 의하여 분해되는 B. thuringiensis 독소 단백질 772) 파밤나방 중장 소화 효소의 Tannic acid에 의한 활성 측정 813) 파밤나방 Proteases의 Zymogram 분석 844) B. thuringiensis 균주의 Trypsin과 Chymotrypsin에 의한 분해능과 Tannic acid의 억제능 확인 855) 중장액, Trypsin으로 소화시킨 B. thuringiensis 균주의 시간에 따른 분해 차이 876) Tannic acid에 의한 파밤나방 중장 소화 효소 인 Trypsin 억제 확인 927) 파밤나방 중장 Proteases 중 Trypsin 활성 분석 및 Tannic acid에 의한 억제능 확인 988) 파밤나방의 Trypsin gene 서열 확인 및 qRT-PCR 분석 1019) 면역형광법(Immunofluorescence) 및 Confocal laser scanning microscope 105결 론 108인 용 문 헌 113초 록 130ABSTRACT 133
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