지원사업
학술연구/단체지원/교육 등 연구자 활동을 지속하도록 DBpia가 지원하고 있어요.
커뮤니티
연구자들이 자신의 연구와 전문성을 널리 알리고, 새로운 협력의 기회를 만들 수 있는 네트워킹 공간이에요.
논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 신재호.
- 발행연도
- 2016
- 저작권
- 경북대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수4
이 논문의 연구 히스토리 (2)
- 이 논문의 후속연구가 궁금하신가요?
- 연관 학술논문 또는 학술발표를 통해 보다 발전된 연구결과를 확인하실 수 있습니다.
- 이 논문의 연구 히스토리 확인하기
초록· 키워드
오류제보하기
Anoxybacillus kamchatkensis G10으로부터 유래한 xylose isomerase의 발현, 정제 및 생화학적 특성 조사
박영준
경북대학교 일반대학원 응용생명과학부 농화학전공
(지도교수 신재호)
Xylose isomerase는 aldose를 ketose로 전환하는 isomerase에 포함되는 효소 중 하나이다. 식품산업에서 fructose syrup을 만드는 공정에는 High Fructose Corn Syrup (HFCS)이 있는데 대부분 화학적인 처리방법에 의해 진행되어 왔다. 화학적으로 이루어지는 HCFS공정 과정이 까다롭고 경제적으로 많은 비용이 든다는 문제점이 있는데 이런 부분들이 대두되면서 생물학적인 방법을 이용하기 위해 xylose isomerase를 HFCS공정에 적용하기 위해 많은 연구가 진행되어 왔다. 이전 연구에서 주로 HFCS공정에 사용되는 xylose isomerase는 mesophilic한 온도 조건에서 생장이 가능한 Streptomyces로부터 유래한 xylose isomerase가 많이 사용되어 왔다. 또한 산업화에 xylose isomerase가 사용되기 위해서는 낮은 pH에서 활성을 가지고 있어야 하며 Ca2+ 이온에 대해 저항성을 가지고 있어야 한다는 전제조건이 있다. 따라서 본 실험에서는 Archaea에서 유래한 내열성 미생물인 Anoxybacillus kamchatkensis G10로부터 유래한 xylose isomerase를 발현, 정제하고 생화학적 특성을 확인함으로써 식품산업에 사용 가능한 효소로써의 가치에 대해 확인하는 것이다.
먼저 A. kamchatkensis G10의 xylose isomerase coding gene을 증폭하고 이를 발현 벡터 pET-21a (+)에 삽입함으로써 construct를 제조하였다. 이를 E. coli BL21 (DE3), BLR (DE3), Rosetta (DE3)에 형질전환하고 발현테스트를 거친 후 최적 조건에서 정제하였다. 정제된 xylose isomerase를 생화학적 특성인 최적 온도, 최적 pH, 열 안정성, pH 안정성, 2가 양이온에 의한 효소활성, kinetic을 조사하였으며 추가적으로 xylose isomerase의 2차구조 분석과 homology modeling을 통한 metal binding site의 3차구조 분석예측을 실시하였다.
Xylose isomerase는 E. coli BL21 (DE3)에서 IPTG를 넣어주지 않았을 때 가장 soluble form의 형태로 발현되는 것을 확인하였고 150 mM의 imidazole 농도에서 가장 순수하게 정제되었다. Molecular weight는 약 45 kDa인 것으로 확인되었으며 tetramer로 존재하는 것으로 확인되었다. 정제된 xylose isomerase는 80°C의 최적온도를 가지고 있으며 pH 7.5에서 가장 높은 최적 pH를 가지고 있다. 열 안정성의 경우 60°C에서 30분 처리하였을 때 63%의 잔여 활성이 있는 것으로 확인되었고 pH 안정성의 경우 pH 7.5에서 300 시간 처리하였을 때 87.5%의 잔여 활성이 있는 것으로 확인되었다. 특이한 점은 pH 4.5에서 300시간 처리하였을 때 63%의 잔여활성이 확인된 점이다. 2가 양이온에 의한 효소활성에서는 Mn2+를 사용하였을 때 가장 높은 활성을 보이는 것으로 확인되었고 특이한 점은 기존에 활성을 저해하는 것으로 알려진 Ca2+와 Zn2+에서도 활성이 있는 것으로 확인된다는 점이다. 기질 친화도와 반응 속도를 나타내는 Km값과 Vmax값은 81.44 mM과 2.237 U mg-1 인 것으로 확인되었고 이 수치는 기존에 보고된 수치들과 유사하거나 낮은 것으로 확인되었다. A. kamchatkensis G10으로부터 유래한 xylose isomerase는 family type II 인 것으로 확인되었으며 catalytic residue와 metal binding residue인 His99와 His269 역시 동일한 위치에 존재하는 것으로 확인되었다. 2차원 구조분석에 따르면 Mn2+를 사용하였을 때 가장 활성 형태를 띄는 것으로 확인하였으며 3차원 구조 분석에서 His269는 metal binding site안에 있는 metal ligand 2에 Mn2+를 붙여주는 역할을 하는 것으로 확인되었다.
본 연구를 통해 A. kamchatkensis G10으로부터 유래한 xylose isomerase는 Ca2+와 Zn2+에서 활성을 가지고 있고 낮은 pH에서도 활성을 가지고 있는 것으로 확인이 되었다. 산업화에 적용되기 위해서는 mutagenesis를 이용한 enzyme 활성 증대에 대한 추가 연구가 필요하고 식품산업에서의 이용가치가 충분히 있다고 생각된다.
박영준
경북대학교 일반대학원 응용생명과학부 농화학전공
(지도교수 신재호)
Xylose isomerase는 aldose를 ketose로 전환하는 isomerase에 포함되는 효소 중 하나이다. 식품산업에서 fructose syrup을 만드는 공정에는 High Fructose Corn Syrup (HFCS)이 있는데 대부분 화학적인 처리방법에 의해 진행되어 왔다. 화학적으로 이루어지는 HCFS공정 과정이 까다롭고 경제적으로 많은 비용이 든다는 문제점이 있는데 이런 부분들이 대두되면서 생물학적인 방법을 이용하기 위해 xylose isomerase를 HFCS공정에 적용하기 위해 많은 연구가 진행되어 왔다. 이전 연구에서 주로 HFCS공정에 사용되는 xylose isomerase는 mesophilic한 온도 조건에서 생장이 가능한 Streptomyces로부터 유래한 xylose isomerase가 많이 사용되어 왔다. 또한 산업화에 xylose isomerase가 사용되기 위해서는 낮은 pH에서 활성을 가지고 있어야 하며 Ca2+ 이온에 대해 저항성을 가지고 있어야 한다는 전제조건이 있다. 따라서 본 실험에서는 Archaea에서 유래한 내열성 미생물인 Anoxybacillus kamchatkensis G10로부터 유래한 xylose isomerase를 발현, 정제하고 생화학적 특성을 확인함으로써 식품산업에 사용 가능한 효소로써의 가치에 대해 확인하는 것이다.
먼저 A. kamchatkensis G10의 xylose isomerase coding gene을 증폭하고 이를 발현 벡터 pET-21a (+)에 삽입함으로써 construct를 제조하였다. 이를 E. coli BL21 (DE3), BLR (DE3), Rosetta (DE3)에 형질전환하고 발현테스트를 거친 후 최적 조건에서 정제하였다. 정제된 xylose isomerase를 생화학적 특성인 최적 온도, 최적 pH, 열 안정성, pH 안정성, 2가 양이온에 의한 효소활성, kinetic을 조사하였으며 추가적으로 xylose isomerase의 2차구조 분석과 homology modeling을 통한 metal binding site의 3차구조 분석예측을 실시하였다.
Xylose isomerase는 E. coli BL21 (DE3)에서 IPTG를 넣어주지 않았을 때 가장 soluble form의 형태로 발현되는 것을 확인하였고 150 mM의 imidazole 농도에서 가장 순수하게 정제되었다. Molecular weight는 약 45 kDa인 것으로 확인되었으며 tetramer로 존재하는 것으로 확인되었다. 정제된 xylose isomerase는 80°C의 최적온도를 가지고 있으며 pH 7.5에서 가장 높은 최적 pH를 가지고 있다. 열 안정성의 경우 60°C에서 30분 처리하였을 때 63%의 잔여 활성이 있는 것으로 확인되었고 pH 안정성의 경우 pH 7.5에서 300 시간 처리하였을 때 87.5%의 잔여 활성이 있는 것으로 확인되었다. 특이한 점은 pH 4.5에서 300시간 처리하였을 때 63%의 잔여활성이 확인된 점이다. 2가 양이온에 의한 효소활성에서는 Mn2+를 사용하였을 때 가장 높은 활성을 보이는 것으로 확인되었고 특이한 점은 기존에 활성을 저해하는 것으로 알려진 Ca2+와 Zn2+에서도 활성이 있는 것으로 확인된다는 점이다. 기질 친화도와 반응 속도를 나타내는 Km값과 Vmax값은 81.44 mM과 2.237 U mg-1 인 것으로 확인되었고 이 수치는 기존에 보고된 수치들과 유사하거나 낮은 것으로 확인되었다. A. kamchatkensis G10으로부터 유래한 xylose isomerase는 family type II 인 것으로 확인되었으며 catalytic residue와 metal binding residue인 His99와 His269 역시 동일한 위치에 존재하는 것으로 확인되었다. 2차원 구조분석에 따르면 Mn2+를 사용하였을 때 가장 활성 형태를 띄는 것으로 확인하였으며 3차원 구조 분석에서 His269는 metal binding site안에 있는 metal ligand 2에 Mn2+를 붙여주는 역할을 하는 것으로 확인되었다.
본 연구를 통해 A. kamchatkensis G10으로부터 유래한 xylose isomerase는 Ca2+와 Zn2+에서 활성을 가지고 있고 낮은 pH에서도 활성을 가지고 있는 것으로 확인이 되었다. 산업화에 적용되기 위해서는 mutagenesis를 이용한 enzyme 활성 증대에 대한 추가 연구가 필요하고 식품산업에서의 이용가치가 충분히 있다고 생각된다.
목차
I. Introduction 1II. Materials and Methods 31. Reagents 32. Strains and plasmid DNA 33. Culture media and conditions 44. Preparation of competent cells 54.1. Escherichia coli competent cell 55. Electrotransformation 65.1. E. coli by electroporation 66. DNA manipulation 76.1. Plasmid extraction from E. coli DH5α 76.2. DNA purification 96.3. Electrophoresis and quantification of DNA 97. Cloning strategy in E. coli 107.1. Restriction enzyme digestion system for expression in E. coli competent cell 108. Polymerase chain reaction (PCR) 108.1. Synthesis of the primer 108.2. Condition of the PCR 119. Analysis of DNA and sequence 1210. Expression of the recombinant xylose isomerase 1210.1. Expression test in E. coli competent cell 1211. Detection and identification the recombinant XI 1411.1. Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 1412. Purification for the recombinant XI 1512.1. Affinity chromatography 1512.2. Size exclusion chromatography 1613. Biochemical characterization and kinetic parameters 1713.1. Enzyme assay 1713.2. Optimum temperature 1713.3. Optimum pH 1813.4. Thermostability 1813.5. pH stability 1813.6. Dialysis and inductively coupled plasma spectroscophy measurement 1913.7. Effect on divalent metal cation 1913.8. Michaelis-Menten and Lineweaver-Burk equation 2014. Histidine residue location, 2D structure investigation and 3D structure prediction 2114.1. Amino acid sequence multiple alignment 2114.2. Circular dichroism spectroscopy 2114.3. Homology modeling 22III. Results 231. Contruction, expression, and purification 231.1. Cloning and Expression pattern 231.1.1 Restriction enzyme digestion system 231.1.2 Expression in E. coli BL21 (DE3), BLR (DE3), and Rosetta (DE3) 241.2. Purification 251.2.1 Affinity chromatography 251.2.2 Size exclusion chromatography 262. Biochemical characterization and kinetic parameter 272.1. Effect of temperature on the recombinant XI activity 272.1.1 Optimum temperature 272.1.2 Thermostability 282.2. Effect of the pH on the recombinant XI activity 292.2.1 Optimum pH 292.2.2 pH stability 302.3. Effect of divalent metal cations of the recombinant XI activity 312.3.1 Inductively coupled plasma spectroscophy 312.3.2 Divalent cations as best activator and resistant against activity 322.4. Kinetic parameter 332.4.1 Michaelis menten and lineweaver-burk equation 333. Histidine residue location, 2D structure investgation, and 3D structure prediction 343.1. Amino acid sequence multiple alignment 343.1.1 Catalytic, metal binding histidine residue and enzyme family type. 343.2. Circular dichroism spectroscophy 363.2.1 CD spectrum of XI-Apo, XI- Ca2+, XI- Zn2+, and XI- Mn2+. 363.3. Homology modeling 373.3.1 Illustration of metal binding site in the recombinant XI 37IV. Discussion 38V. References 41VI. Abstract in Korean 49
최근 본 자료
댓글(0)
0