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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 김흥태
- 발행연도
- 2016
- 저작권
- 충북대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수3
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배에 검은별무늬병을 일으키는 병원균인 Venturia nashicola는 병반으로부터 병원균을 분리하여 한천희석법을 통한 저항성 모니터링을 실시할 경우 균의 생장이 매우 느려 신속한 저항성 모니터링을 실시할 수가 없다. 따라서 신속한 살균제 저항성 모니터링을 실시하기 위해 살균제 저항성 분자 마커를 이용한 모니터링 방법을 확립하였고, 이를 실제 포장 집단에 적용하여 살균제 저항성 모니터링을 실시하였다.
V. nashicola 5개 균주를 이용하여 benzimidazole계 살균제인 carbendazim과 benomyl, 그리고 carbendazim과 N-phenylcarbamate계 살균제인 diethofencarb 혼합제에 대한 균주의 반응을 조사하였다. 그 결과 세 약제에 모두 감수성 반응을 보인 KCTC6484와 MAFF615002 균주와 benomyl과 carbendazim에 대해서 저항성이지만 혼합제에 대해 감수성 반응을 보인 MAFF615003과 MAFF615029 균주, 세 살균제 모두에 대해 저항성을 보인 MAFF615023 균주로 구분되었다. 이들 5균주의 β-tubulin 유전자 아미노산 서열을 분석한 결과 198번째 아미노산이 glutamate(GAG)에서 carbendazim에 대해서 저항성인 균주에서는 alanine(GCG)으로, carbendazim과 합제 모두에 대해서 저항성인 균주에서는 lysine(AAG)로 치환되어 있는 것을 확인하였다. 이 변이된 부분을 대상으로 PCR-RFLP, allele-specific PCR(AS-PCR), quantitative sequencing(QS)을 수행하여, 분자마커를 이용하는 살균제 저항성 모니터링 방법을 확립하였다. PCR-RFLP는 PCR을 통해 증폭된 β-tubulin 유전자 산물에 제한효소 Alw26I과 BstUI을 처리하였고 잘려진 PCR 산물 단편의 크기와 개수를 통해 세 집단으로 구분하였다. 또한 β-tubulin 유전자의 198번째 codon의 변이부위에 특이적으로 결합할 수 있는 primer를 제작하고 AS-PCR을 수행하여, 저항성의 여부를 규명할 수 있었다. 마지막으로 QS을 이용하여 2015년 35개소 포장에 대하여 병원균 포장 집단에 대한 살균제 저항성 모니터링을 시행하였고, 실험 포장 집단은 모두 benzimidazole계 살균제에 저항성인 것으로 규명하였다.
본 연구를 통해 분자 마커를 이용한 V. nashicola의 benzimidazole계 살균제에 대한 저항성 모니터링법을 확립하였으며, 2015년 채집한 배 검은별무늬병균 포장 집단은 모두 benzimidazole계 살균제에 대해 저항성인 것으로 나타났다. 따라서 포장에서 배 검은별무늬병의 방제를 위해서 benzimidazole계 살균제를 사용한 것은 매우 위험하기 때문에 포장에서 병원균 집단의 살균제 저항성 정도를 확인한 후, 사용 여부를 신중히 고려해야 하는 것이 타당하다고 생각한다.
V. nashicola 5개 균주를 이용하여 benzimidazole계 살균제인 carbendazim과 benomyl, 그리고 carbendazim과 N-phenylcarbamate계 살균제인 diethofencarb 혼합제에 대한 균주의 반응을 조사하였다. 그 결과 세 약제에 모두 감수성 반응을 보인 KCTC6484와 MAFF615002 균주와 benomyl과 carbendazim에 대해서 저항성이지만 혼합제에 대해 감수성 반응을 보인 MAFF615003과 MAFF615029 균주, 세 살균제 모두에 대해 저항성을 보인 MAFF615023 균주로 구분되었다. 이들 5균주의 β-tubulin 유전자 아미노산 서열을 분석한 결과 198번째 아미노산이 glutamate(GAG)에서 carbendazim에 대해서 저항성인 균주에서는 alanine(GCG)으로, carbendazim과 합제 모두에 대해서 저항성인 균주에서는 lysine(AAG)로 치환되어 있는 것을 확인하였다. 이 변이된 부분을 대상으로 PCR-RFLP, allele-specific PCR(AS-PCR), quantitative sequencing(QS)을 수행하여, 분자마커를 이용하는 살균제 저항성 모니터링 방법을 확립하였다. PCR-RFLP는 PCR을 통해 증폭된 β-tubulin 유전자 산물에 제한효소 Alw26I과 BstUI을 처리하였고 잘려진 PCR 산물 단편의 크기와 개수를 통해 세 집단으로 구분하였다. 또한 β-tubulin 유전자의 198번째 codon의 변이부위에 특이적으로 결합할 수 있는 primer를 제작하고 AS-PCR을 수행하여, 저항성의 여부를 규명할 수 있었다. 마지막으로 QS을 이용하여 2015년 35개소 포장에 대하여 병원균 포장 집단에 대한 살균제 저항성 모니터링을 시행하였고, 실험 포장 집단은 모두 benzimidazole계 살균제에 저항성인 것으로 규명하였다.
본 연구를 통해 분자 마커를 이용한 V. nashicola의 benzimidazole계 살균제에 대한 저항성 모니터링법을 확립하였으며, 2015년 채집한 배 검은별무늬병균 포장 집단은 모두 benzimidazole계 살균제에 대해 저항성인 것으로 나타났다. 따라서 포장에서 배 검은별무늬병의 방제를 위해서 benzimidazole계 살균제를 사용한 것은 매우 위험하기 때문에 포장에서 병원균 집단의 살균제 저항성 정도를 확인한 후, 사용 여부를 신중히 고려해야 하는 것이 타당하다고 생각한다.
목차
차 례Abstract ⅲList of tables ⅴList of figures ⅵⅠ. 서 론 1Ⅱ. 재료 및 방법 61. 실험에 사용한 균주 62. 실험에 사용한 살균제 63. V. nashicola에 대한 살균제의 균사생장 억제 효과 조사 84. 병원균의 gDNA 추출 85. V. nashicola의 β-tubulin 유전자 증폭과 염기서열 분석 96. β-tubulin 유전자의 염기서열 변화를 이용한 PCR-RFLP 97. β-tubulin 유전자의 염기서열 변화를 이용한 Allele-specific PCR(AS-PCR) 128. β-tubulin 유전자의 E198A 돌연변이를 이용한 Quantitative sequencing(QS) 121) 병원균의 β-tubulin 유전자 증폭 122) Quantitative Seqeuncing의 민감도 확인 139. 검은별무늬병균에 감염된 조직을 사용한 살균제 저항성 모니터링131) 감염된 배 조직에서 DNA 추출 142) 병징으로부터 β-tubulin 유전자 증폭 143) 포장 집단에 대한 모니터링 15Ⅲ. 결과 161. 살균제 저항성 분자마커를 이용한 모니터링 방법 확립 161) 한천희석법을 통한 benzimidazole계 살균제의 효과 검정 162) β-tubulin 염기서열 분석 193) β-tubulin 유전자를 이용한 PCR-RFLP 224) β-tubulin 유전자를 이용한 allele-specific PCR (AS-PCR) 245) β-tubulin 유전자의 E198A 돌연변이를 이용한 QS 272. 병원균 포장 집단에 대한 대량 모니터링 301) V. nashicola 분생포자의 포자 발아 조사 302) 분자마커를 이용한 대량 모니터링 36(1) 병든 조직에서 β-tubulin 유전자 증폭 36(2) 발병 조직으로부터 추출한 DNA를 이용한 Quantitative Sequencing(QS)과 AS-PCR 39(3) 포장 집단에 대한 모니터링 42Ⅳ. 고찰 44Ⅴ. 요약 50Ⅵ. 인용문헌 52
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