인간각질형성세포에서 Phytol의 항산화, 항염 및 세포노화억제 효능 연구 :Anti-oxidant, Anti-inflammatory, and Anti-senescence Effects of Phytol on HaCaT keratinocytes

정선희

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자료유형: 학위논문

저자정보: 정선희 (건국대학교, 건국대학교 대학원)

지도교수: 안성관

발행연도: 2016

저작권: 건국대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수7

이 논문의 연구 히스토리 (2)

2017

인간각질형성세포에서 Phytol의 항산화 효능

정선희 아시안뷰티화장품학술지 2017.01 학술저널

2016

인간각질형성세포에서 Phytol의 항산화, 항염 및 세포노화억제 효능 연구

정선희 생물공학 2016.01 학위논문

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본 연구는 화장품 원료로서 phytol의 인간각질형성세포(HaCaT keratinocytes)에서 산화적스트레스 유발자인 H2O2에 대한 항산화, 항염, 세포보호, 세포노화억제 효능을 검증하는데 목적이 있다. Phytol의 세포효력을 검증하기 위해서 세포생존율, DPPH assay, ROS scavenging activity assay, flow cytometry analysis, caspase-3 정량분석, quantitative real-time PCR, SA-β-galactosidase assay을 실시하였다. H2O2 1000 μM 농도에서 세포생존율이 현저히 감소하여 H2O2 750 μM을 실험에 사용하였고, H2O2 750 μM처리된 HaCaT keratinocytes에 phytol 처리시 20 μM이상의 농도에서 세포생존 회복율이 감소하여 10 μM 이하의 농도로 실험하여 다음과 같은 결과를 얻었다. Phytol의 항산화 효과를 알아보기 위한 DPPH assay에서는 free radical 소거능이 증가하였고, 세포내 ROS 정량분석 실험에서는 ROS 소거능을 보여 주어 항산화 효능을 확인 하었다. qRT-PCR 실험에서는 항산화 유전자로 알려진 SOD1, SOD2, CAT mRNA가 phytol의 농도 의존적으로 발현이 증가하였고, GSH 또한 phytol 농도 의존적으로 증가하며 항산화 기능이 회복되는 것을 확인하였다. 염증유발에 관련된 NF-κB, TNF-α, IL-6, IL-8 mRNA는 phytol농도 의존적으로 감소하며 phytol의 항염 효능을 확인하였다. FACS 실험을 통한 세포주기 분석에서는 phytol의 세포주기 정지 억제 효능을 보여주었고, qRT-PCR 실험에서 NRF2, HO-1, 14-3-3σmRNA 발현이 증가, cyclin B mRNA발현이 감소하며 세포보호효과를 보여주었다. Caspase-3 activity assay에서도 caspase-3발현이 phytol의 농도 의존적으로 감소하며 세포보호효능을 확인하였다. Phytol이 세포노화에 미치는 영향을 확인하기 위해서 SA-β-galactosidase assay를 실시하였고, phytol 처리시 세포노화가 억제되고 있음을 확인하였다. 본 연구를 통해 phytol의 항산화, 항염, 피부세포에서의 노화억제 효력을 검증하였고 이러한 연구결과는 잠재적인 노화억제 화장품 소재로서 phytol의 활용가능성을 제시하였다.

The aim purpose of this study is to evaluate anti-oxidant, anti-inflammatory, and protective effects of phytol as an ingredient of cosmetic against H2O2 in HaCaT keratinocytes. Cell viability assay, DPPH assay, ROS scavenging activity assay, flow cytometry analysis, caspase-3 activity assay, quantitative real-time PCR and SA-β-galactosidase assay were performed to verify the cell effectiveness of phytol. To determine the experimental concentration of H2O2 and phytol in HaCaT keratinocytes, WST-1 assay was examined with treatments of various H2O2 and phytol concentrations in HaCaT keratinocytes. As a result 750 μM H2O2 and 10 μM phytol treatment was chosen for the experiment. To examine the free radical scavenging and intracellular ROS scavenging activities of phytol, DPPH assay and DCF-DA analysis were performed. Cytoprotective effects of phytol against hydrogen peroxide-induced oxidative stress were examined in a dose dependent manner. qRT-PCR data showed that the expression of SOD1, SOD2, CAT mRNA, very well-known as anti-oxidant genes, were increased by phytol in a dose dependent manner. Intracellular GSH levels were also increased by phytol in a dose dependent manner, which showed that antioxidant effect is recovered by phytol. NF-κB, TNF-α, IL-6, IL-8 mRNA, related in inflammation, were decreased by phytol in a dose dependent manner, which showed that phytol has anti-inflammatory effects. The inhibition effect of phytol in cell cycle arrest was investigated by FACS analysis. NRF2, HO-1, 14-3-3σ mRNA was increased, and cyclin B mRNA was decreased in qRT-PCR analysis, which showed protective effects of phytol. Caspase-3 activity data also demonstrated protective effects of phytol by showing the reduction the expression of caspase-3 by phytol in a dose dependent manner. In order to analyse whether phytol affects the cellular senescence, SA-β-galactosidase was performed, and the results showed that phytol inhibit the cellular senescence. The results suggest possibility of phytol as cosmetic ingredient which enhance a defense system and slow an ageing process for skin.

#파이톨 #활성산소종 #인간각질형성세포 #항염

Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 연구 재료 및 방법 8
1. 세포배양 8
2. 시료처리 8
3. 세포 생존율 측정 8
4. 세포주기분석 9
5. 항산화효과 측정 9
6. 세포노화분석 10
7. 세포내 활성산소종 정량분석 10
8. Quantitative real-time PCR 분석 11
9. Caspase-3 activity 정량분석 12
10.GSH 측정 13
11. 통계처리 13
Ⅲ. 연구결과 및 고찰 14
1. 세포독성연구 14
1.1 인간각질형성세포에서 phytol의 독성 14
1.2 인간각질형성세포에서 H2O2에 의한 세포독성 16
1.3 H2O2에 의한 phytol 세포손상 억제 18
2.항산화효과 연구 20
2.1 DPPH 라디칼 소거활성 20
2.2 세포내 활성산소종에 미치는 영향 22
2.3 SOD1, SOD2 mRNA에 미치는 영향 24
2.4 CAT mRNA에 미치는 영향 26
2.5 GSH에 미치는 영향 28
3.인간각질형성세포에서 phytol의 항염 효과 연구 31
3.1 TNF-α mRNA에 미치는 영향 31
3.2 COX-2 mRNA에 미치는 영향 33
3.3 IL-6, IL-8 mRNA에 미치는 영향 35
4. 인간각질형성세포에서 phytol의 세포보호 효과 연구 38
4.1 Cell cycle에 미치는 영향 38
4.2 NRF2 mRNA에 미치는 영향 41
4.3 HO-1 mRNA에 미치는 영향 43
4.4 14-3-3-σ mRNA와 Cyclin B mRNA 미치는 영향 45
4.5 Caspase-3에 미치는 영향 48
5. 인간각질형성세포에서 phytol의 세포노화억제 효과 연구 50
5.1 세포노화에 미치는 영향 50
Ⅳ. 결론 52
참고문헌 54
국문초록 64

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