점액포자충은 점액포자충문 (Phylum Myxozoa)에 속하는 기생충으로 현재 2,300 여종이 알려져 있으며 거의 대부분 어류기생성으로 어류와 수생무척추동물을 교대숙주로 이용하는 이상성 생활환 (biphasic life cycle)을 갖는다. 쿠도아속 (Genus Kudoa)의 점액포자충은 4개 또는 그 이상의 극낭을 가지는 것을 특징으로 하며, 전 세계적으로 90 여종 이상이 보고되고 있다. 주로 해산어류의 근육에 기생하지만 뇌, 심장, 신장, 난소 등에 기생하는 종들도 있다. 어류에 대한 병원성은 뇌에 기생하는 종 이외에는 낮은 편이며, 근육에 기생하는 종은 근육 내에 직경 1∼2 mm의 백색 시스트 (cyst)를 형성하는 type과 육안으로는 확인이 불가능하지만 어류의 사후 근육을 융해시켜 Jelly meat를 형성하는 type이 있는데, 이 두 type 모두 어류의 상품가치를 저하시키므로 경제적으로 문제시된다. 일반적으로 점액포자충문에 속하는 기생충은 사람에게 무해한 것으로 알려져 있으나 최근 일본에서 넙치 (Paralichthys olivaceus)를 생식한 후 식중독 유사증상을 일으키는 문제가 제기되어 역학조사를 실시한 결과, 넙치의 근육에 기생하는 쿠도아속 점액포자충 Kudoa septempunctata가 원인으로 의심된다고 보고하였다.
넙치는 국내 해산어류 양식 전체생산량의 절반을 차지하는 주요한 양식어종으로 전체 생산량의 10% 정도가 수출되고 있는데 대부분 일본으로 수출되고 있어 대일 의존도가 매우 높다. 하지만, 최근 국내에서 생산되어 일본으로 수출되는 넙치에서 K. septempunctata의 감염이 보고되면서 검역 등 식품위생 안전관리 강화로 대일 수출 물량이 급감하고 있어 대책마련이 시급하다.
본 연구는 K. septempunctata의 국내산 양식넙치 감염현황을 파악하기 위해 넙치양식 현장에서 유용하게 사용할 수 있는 검사법을 확립하고 현장에 적용하였으며 넙치 사육환경 및 주변환경 조사를 통하여 K. septempunctata의 생활사를 파악하여 K. septempunctata 감염의 예방 및 대책 마련을 위해 수행되었다.
현재까지 알려진 K. septempunctata의 진단법은 현미경 관찰법, PCR법, real-time PCR법 등이 있다. 현미경 관찰법의 경우 성숙포자만 관찰이 가능하고 검출 감도가 낮아 조기진단에 활용하기 어렵고, PCR과 real-time PCR의 경우 검출 감도 및 특이성이 높아 조기진단에 활용 가능하지만 고가의 장비와 시약이 필요해 현장시료에 적용하기 어려운 점이 있다. 본 연구에서 K. septempunctata의 진단을 위해 개발한 LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)법은 PCR법과 비교하여 약 10배 높은 검출 감도가 확인되었으며, 근연종과의 감별진단이 가능하여 신뢰할 만한 진단방법임이 증명되었다. 또한 LAMP product에 SYBR Green Ⅰ을 첨가하면 별도의 전기영동 장치 없이 육안으로 손쉽게 K. septempunctata의 감염 여부를 확인할 수 있어 현장에서 넙치의 K. septempunctata의 감염 유무를 파악하거나 대규모 모니터링에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
K. septempunctata의 감염이 보고된 제주도 내 넙치 양식장에서 성어와 육성어를 샘플링한 후 기존에 알려진 현미경 관찰법, PCR법과 비교하여 LAMP법의 유효성을 평가해보았다. 성어의 경우 현미경 관찰법, PCR법, LAMP 법으로 각각 6.4% (11/172), 9.9% (17/172), 34.3% (59/172)의 감염율이 확인되었고, 육성어의 경우 현미경 관찰법, PCR법, LAMP 법으로 각각 11.6% (22/189), 27.0% (51/189), 55.0% (104/189)의 감염율이 확인되어 LAMP법의 검출 감도가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
체중에 따른 K. septempunctata의 감염율 차이를 비교하여 감염시기를 추정해 보았다. 현미경 관찰법의 경우 400~800 g에서, PCR법과 LAMP법은 400 g 미만의 넙치에 검출율이 높았는데 이러한 검출율의 차이는 400 g 미만의 넙치의 경우 K. septempunctata의 성숙하지 않은 포자가 체내에 다수 존재하기 때문으로 추정된다. 그리고, 현미경 관찰시 70 g 미만의 넙치에서 성숙한 K. septempunctata 포자가 발견되어 실질적인 감염은 이보다 이른 종묘시기에 이루어질 수 있을 것으로 추정된다.
K. septempunctata의 감염이 넙치 종묘에서 유래될 것이라는 추정을 기초로 넙치 종묘의 전국적인 감염현황을 확인해 보았으며, 추가로 혈액과 신장을 샘플링하여 넙치 체내에서의 감염경로를 추정해 보았다. 현미경 관찰결과 넙치 종묘에서는 K. septempunctata의 성숙포자를 발견하지 못하였으며 PCR 결과 제주 지역 1곳의 넙치 종묘장에서 양성시료가 1 set 확인되었다. 또한 real-time PCR 결과 제주 이외의 일부 지역의 종묘에서도 105/g 이상의 rDNA copy 수가 확인되어 넙치 종묘가 성장하면서 넙치 체내에서 분열 및 증식하여 문제시 될 수 있으므로 지속적인 모니터링이 필요할 것으로 판단되었다.
넙치를 죽이지 않고 K. septempunctata의 감염여부를 확인하고, K. septempunctata의 넙치 체내에서의 감염 경로를 확인하고자 PCR 법으로 혈액을 분석하였다. 분석결과 넙치의 혈액은 동일한 개체의 근육에 비해 2배 가량 K. septempunctata의 검출율이 높았는데, 이는 해당 시료가 감염 초기단계라 K. septempunctata가 근육에 아직 도달하지 못하였기 때문으로 추정되며 또한 혈액샘플에서 PCR 양성반응으로 확인된 일부 시료의 경우 sequencing 결과 K. neurophila로 동정되어 혈액을 사용한 진단결과는 신뢰도가 떨어질 것이라 판단되었다. 또한, 신장 샘플의 경우 조사한 성어 10마리 모두 음성으로 확인되어 K. septempunctata의 신장시료를 사용한 진단은 신뢰도가 낮을 것으로 판단되었다.
K. septempunctata의 물을 매개로 하는 감염경로를 확인하고, 생활사의 완성에 관여하는 교대숙주를 탐색하기 위해 양식장의 사육수 (유입수, 배출수)와 양식장 내의 환형동물 그리고 양식장 주변 환경의 환형동물을 대상으로 PCR법, real-time PCR법을 사용하여 K. septempunctata의 존재 유무를 조사하였고, 환형동물의 경우 추가로 well-plate 검사법을 사용하여 환형동물에서 방선포자충의 방출 여부를 확인해 보았다.
사육수 조사 결과 연중 산발적으로 K. septempunctata DNA가 확인되었지만 일부 (2013년 11월, 2014년 6월과 8월) 시료에서는 K. septempunctata의 DNA가 전혀 검출되지 않았는데, 아마도 이 시기는 사육수에 존재하는 K. septempunctata가 수중에서 분해되거나 환형동물 또는 넙치의 체내에 감염되는 시기와 관련 있을 것이라 추정할 수 있었다. 환형동물 조사 결과 well plate 법으로는 환형동물에서 방출하는 방선포자충의 존재를 확인하지 못하였지만, PCR 결과 늦봄~초여름에 양성 비율이 peak를 이룬 후 급격히 떨어지는 패턴이 확인되었는데 사육수에서 K. septempunctata의 DNA가 전혀 검출되지 않는 시기와 유사하여 아마도 늦봄~초여름 이후가 넙치에 방선포자충이 감염되는 시기와 관련있을 것이라고 추정할 수 있었으며 Naineris 속의 다모류에서는 다른 환형동물에 비해 특이적으로 높은 검출율이 확인되어 K. septempunctata의 생활사에 관여할 가능성이 있어 지속적인 모니터링을 통해 생활사의 규명이 필요할 것이다.
현재까지 점액포자충을 구제하는 약제가 사용되고 있지 않아 생활사 규명을 통한 환경 제어가 점액포자충 감염증에 대한 유일한 대책으로 여겨지고 있다. K. septempunctata의 생활사를 규명하기 위해서는 본 연구에서 사용된 방법 이외에도 대규모로 유전자를 screening 할 수 있는 metagenome 분석법 등을 사용하여 K. septempunctata의 감염이 만연한 지역과 K. septempunctata의 감염이 보고되지 않은 지역간의 생물학적 군집을 비교해 본다면 K. septempunctata의 교대숙주 및 생활사를 규명하는데 도움이 될 것으로 판단된다. 또한 K. septempunctata의 생활사를 규명하기 위해서는 본 연구에서 환형동물의 관찰에 사용한 well plate법 이외의 방법을 사용하여 방선포자충의 형태를 확인하여야 한다.
일본에서는 양식 넙치에 기생하는 K. septempunctata가 넙치를 섭취한 후 식중독 유사증상을 일으키는 주요 원인으로 해마다 보고되어 새로운 식품매개 질환으로 인식되고 있다. 하지만, 현재까지 국내에서는 K. septempunctata에 의한 감염사례가 보고되지 않아 실제로 K. septempunctata가 사람에게 임상증상을 유발하는지는 불확실하다. 따라서, 우리나라에서도 넙치를 섭취한 후 식중독 유사증상을 보이는 환자들을 대상으로 분변 샘플링 등을 통한 역학조사를 수행하여 실제로 K. septempunctata가 사람에게 식중독 유사증상을 나타내는지 확인해야 할 것이다.

Myxozoans are parasitic metazoans belonging to Phylum Myxozoa, and approximately 2,300 species are described at present time. Most of them are parasites of fish and have biphasic life cycles involving teleosts and aquatic invertebrates as alternate hosts. The genus Kudoa includes a single genus having four or more polar capsules, and more than 90 species have been reported worldwide. Most of them are parasitic in muscle of marine fish, however, some are seen in brain, heart, kidney, ovary and so forth. Pathogenicity against fish is generally low, except for the species parasitic in the brain. There are two types in fish muscle infecting Kudoa species: One type produces whitish cysts visible with the naked eyes and the other type causes post-mortem myoliquefaction. These two types cause economic loss because infected fish become unmarketable. Generally, myxosporean parasites are known to be harmless to human. However, serial outbreaks in humans, associated with ingestion of raw olive flounder (Paralichthys olivaceus), have been recently reported in Japan and the epidemiological analysis demonstrated that Kudoa septempunctata, found in muscles of olive flounder is suspicious of a cause of the outbreaks.
Olive flounder is a commercially important fish species in Korean aquaculture, occupying half of the total production of marine fish aquaculture. Approximately 10% of total production is exported to Japan. However, the infection has been also reported from olive flounder in Korea, produced for exportation to Japan. The exportation of olive flounder to Japan is now notably decreasing due to the demand of strong food safety management. Thus, it is urgently needed to establish proper countermeasure.
In this study, a diagnostic method for K. septempunctata infection in olive flounder was evaluated and applied to the field samples. In addition, environmental water and marine invertebrates in olive flounder aquaculture farms were sampled and investigated for speculating the life cycle of K. septempunctata, to find prevention and control method in olive flounder farms.
Current diagnostic methods of K. septempunctata are microscopic observation, PCR and real-time PCR. Microscopic observation is difficult to detect developmental stage of K. septempunctata and early detection is not possible due to low sensitivity. PCR and real-time PCR are highly sensitive and can be utilized for early diagnosis, but these techniques need expensive equipments and reagents. The LAMP assay is found to be ten times more sensitive than the conventional PCR method and species-specific. Moreover, SYBR Green Ⅰ can be used for simple visual detection of the LAMP product with the naked eye. Therefore, this method is useful for a large-scale monitoring of K. septempunctata in olive flounder farms.
The LAMP assay was evaluated and compared with the microscopic observation and PCR by using olive flounder juveniles and adults from aquaculture farms in Jeju island. Microscopic observation, PCR and LAMP assay revealed that the prevalence rate of K. septempunctata was 6.4% (11/172), 9.9% (17/172), 34.3% (59/172) in adult olive flounder, respectively. For juveniles, the prevalence rate was 11.6 (22/189), 27.0 (51/189), 55.0% (104/189), respectively. Thus, LAMP was found to be more sensitive than microscopic observation and PCR.
The prevalence of K. septempunctata in olive flounder according to different body weight were estimated. Detection rate was the highest in olive flounder with 400~800 g body weight by microscopic observation whereas detection rate by PCR and LAMP were high in oliver flounder with less than 400 g body weight. This is thought to be due to the existence of immature spores in olive flounder weighting less than 400 g. The infection may occur at the fry stage of olive flounder because mature spores were observed in olive flounder weighting less than 70 g.
Olive flounder fry (281 sets) were collected from 33 farms in Korea and examined for K. septempunctata infection by microscopic observation, PCR and real-time PCR. No sample sets were found to be positive by microscopic observation and only one sample (Jeju) harbored K. septempunctata by PCR and subsequent sequencing. However, some sample sets showed considerably high rDNA copies numbers (about 105/g), regardless of sampling locations. These fry with a highr DNA copy number of K. septempunctata can harbor mature spores as the fish grows, because K. septempunctata can proliferate and produce mature spores in the infected fish. Thus, continuous monitoring is necessary.
Blood were examined to check the migration route of K. septempunctata in olive flounder and to diagnose the infection without killing the fish. The detection rate with blood samples was twice as high as with muscle samples. This higher detection rate in blood samples suggest that K. septempunctata may proliferate in blood stream, in which mature spores cannot be detected. Some of the PCR-positive blood samples had K. neurophila sequences, not K. septempunctata sequences. Therefore, blood samples seem to be inappropriate for PCR diagnosis of K. septempunctata. Similarly, kidney samples are thought to be not appropriate for diagnosis by using PCR.
For investigating infection route and life cycle, environmental waters (inlet and outlet) and marine invertebrates were sampled from coastal water as well as olive flounder farms. Samples were investigated by PCR and real-time PCR. In addition, marine polychaetes were maintained in well plates and observed for actinospores.
K. septempunctata DNA was sporadically detected through the year, but no DNA was detected on November 2013, June and August 2014. This is thought to be related with the K. septempunctata infection of polychaetes or fish, or possibly degradation of actinospores. Although the actinosporean stage of K. septempunctata was not detected by well plate method, K. septempunctata is thought to be released from the possible alternate hosts during late spring and early summer because the percentage of PCR-positive individuals were the highest in May and decreased since then. These periods are thought to be related with the onset of infection in olive flounder. The polychaete (Genus Naineris) showed high detection rate, when compared with other annelid worms. Further investigation by continuous monitoring are necessary to reveal the life cycle of K. septempunctata.
To date, there are no clear chemotherapic control method for myxosporean infection. Therefore, the current disease control strategies can be only developed based on the transmission biology of myxosporean. In order to reveal the life cycle, comparative study of marine invertebrate fauna of K. septempunctata positive region and K. septempunctata negative region by metagenome analysis will be helpful. In addition, other observation methods should be tried for finding actinosporean stages.
K. septempunctata is considered as a new cause of food poisoning-like symptoms in Japan, and many clinical outbreaks after ingesting olive flounder have been reported. However, no human outbreaks has been reported K. septempunctata infection after ingesting raw olive flounder in Korea. It is uncertain whether they cause clinical outbreaks in Korea and epidemiolgical studies are required by examining the fecal samples of suspicious patients.