목적 : 골다공증은 골대사의 불균형과 관련된 대사성 골질환이다. 골다공증 치료제의 부작용이 많이 보고되면서 한약이 새로운 골다공증 치료제로 관심을 받고 있다. 본 연구를 통해 녹용, 부자 단일 물 추출물 그리고 녹용과 부자로 구성된 용부탕 물 추출물의 RANKL로 유도된 파골세포의 분화 억제와 골 흡수 억제 효과를 알아보고자 하였다.
방법 : 녹용, 부자, 용부탕 물 추출물의 파골세포 분화 억제 효과를 보기 위해 골수대식세포를 배양하여 실험하였다. 파골세포 분화를 조절하는 전사인자인 NFATc1, c-Fos과 TRAP의 유전자 발현을 보기 위해 RT-PCR로 관찰하였고, NFATc1, c-Fos, MAPKs, β-actin의 단백질 발현은 Western blot으로 확인하였다. 또한 녹용, 부자, 용부탕 물 추출물을 LPS로 유도한 골 손실 마우스 동물모델에 투여하여 생체에 미치는 효과를 확인하였다.
결과 : 1. 녹용, 부자 그리고 용부탕 물 추출물은 세포독성 없이 RANKL로 유도된 파골세포의 분화에 유의한 억제효과를 보였다. 2. 용부탕 물 추출물은 c-Fos와 NFATc1의 유전자 발현을 유의하게 억제하였다. 3. 녹용, 부자 단일 물 추출물은 NFATc1의 단백질 발현을 유의하게 억제하였고, 용부탕 물 추출물은 c-Fos와 NFATc1의 단백질 발현을 유의하게 억제하였다. 4. 용부탕 물 추출물은 MAPKs 중 AKT, p38, JNK의 인산화를 유의하게 억제하였고, I-κB의 가수분해를 유의하게 억제하였다. 5. 부자 단일 물 추출물은 LPS로 유도한 염증성 골 손실 마우스 동물모델에서 골 손실을 유의하게 회복시켰다.
결론 : 세포내 실험에서 용부탕 물 추출물이 녹용과 부자 단일 물 추출물보다 더욱 유의한 파골 세포의 분화 억제효과를 보였다. 동물실험에서는 부자 단일 물 추출물이 골 손실을 유의하게 억제하였다. 따라서 용부탕이 골다공증 같은 골 손실 질환에 유용한 치료제로 응용 될 수 있을 것이라 사료된다.
Objective : Osteoporosis is metabolic bone disease associated with an imbalance of bone remodeling. To avoid the many side effects of treatment with chemical compounds, traditional Korean medicine has received attention for the treatment of osteoporosis. This study was performed to evaluate the effects of water extract of Cervi Parvum Cornu(CPC), Aconiti Lateralis Radix Preparata(ALR), and Yongbu-tang(YBT) on suppressing the Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand(RANKL)-induced osteoclast differentiation and bone resorption.
Methods : The effects of CPC, ALR, YBT extracts on osteoclast differentiation were determined by culture of bone marrow macrophage(BMM). The mRNA expression levels of Nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1(NFATc1), c-Fos and Tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) in BMMs were analyzed by RT-PCR. Similarily, the protein expression levels of NFATc1, c-Fos, Mitogen-activated protein kinase(MAPK)s and β-actin in cell lysates were measured by using Western blotting. In addition, I determined the effects of CPC, ALR and YBT extracts by means of Lipopolysaccharide(LPS) -induced bone-loss with mice.
Results : 1. CPC, ALR and YBT extracts showed remarkable inhibition on RANKL -induced osteoclast differentiation without cytotoxicity. 2. YBT extract significantly reduced the mRNA expression levels of c-Fos, NFATc1. 3. CPC, ALR extracts significantly reduced the protein expression level of NFATc1. YBT extract significantly reduced the protein expression levels of c-Fos, NFATc1. 4. YBT extract significantly reduced the protein expression levels of AKT, p38, JNK. And YBT extract suppressed degradation of I-κB. 5. ALR extract significantly restored the bone erosion by LPS treatment in mice.
Conclusions : In vitro data showed that YBT extract showed more remarkable inhibition on osteoclast differentiation rather than CPC, ALR extracts. And in vivo data showed that ALR extract showed remarkable inhibition on bone resorption. Thus, I expect that YBT extract can be a useful treatment for bone-loss disease such as osteoporosis.
목차
Ⅰ. 緖 論 1Ⅱ. 재료 및 방법 31. 재료 31) 시약 32. 방법 31) 약물의 추출 및 제조 32) 파골세포 배양 및 분화 억제 43) 독성검사 44) Western Blot Analysis 55) RT-PCR 분석 56) 동물실험 67) 통계분석 6Ⅲ. 실험 결과 81. 파골세포 분화 억제 효과 81) 파골세포 분화에 미치는 녹용, 부자 단일 물 추출물의 효과 82) 파골세포 분화에 미치는 용부탕 물 추출물의 효과 112. 녹용, 부자, 용부탕 물 추출물의 세포독성 133. RANKL에 의한 파골세포 유도인자 발현 억제효과 141) RANKL에 의한 유전자 발현에 대한 녹용, 부자 단일 물 추출물의 효과 142) RANKL에 의한 유전자 발현에 대한 용부탕 물 추출물의 효과 164. RANKL에 의해 유도되는 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현 억제 효과 181) RANKL에 의해 유도되는 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현에 미치는 녹 용, 부자 단일 물 추출물의 효과 182) RANKL에 의해 유도되는 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현에 미치는 용 부탕 물 추출물의 효과 205. 파골세포 분화의 신호전달 경로에 미치는 효과 221) RANKL에 의해 유도되는 MAPKs와 IκB에 미치는 녹용, 부자 단일 물 추출물의 효과 222) RANKL에 의해 유도되는 MAPKs와 IκB에 미치는 용부탕 물 추출물의 효과 246. LPS-유도 골 손실에 미치는 효과 26Ⅳ. 考 察 29Ⅴ. 結 論 37