실험 목적 : 이 연구의 목적은 RANKL가 유도하는 파골세포 분화가 숙지황(RRP), 토사자(CS) 및 이들의 혼합물(쌍보환, SBH)의 물 추출물에 의해 억제되는 효과가 있는지 알아보고자 하는 것이다. 또한 지질다당류(LPS)로 유도된 골다공증 모델에서 RRP, CS 및 SBH이 골다공증을 억제하는 효과가 있는지 알아보고자 한다.
실험 방법 : RANKL를 처리하여 파골 세포의 분화를 촉진한 뒤 RRP, CS 및 SBH를 투여하여 효과를 관찰한다. 또한, RT-PCR 이라는 방법을 이용하여 골수 대식세포(BMMs)의 NFATc1, C-Fos, TRAP, GAPDHS 의 mRNA 발현 수준을 분석한다. 비슷하게, Western blotting 이라는 방법을 통해 세포 용해물에서 NFATc1, C-Fos, MAPKs 및 β-actin의 단백질 발현 수준을 분석 하였다. 그 다음, 지질다당류(LPS)로 유도된 뼈 손실 마우스를 사용하여 RRP, CS 및 SBH의 골다공증 저항효과를 밝혀냈다.
실험 결과 : RRP, CS 및 SBH는 RANKL가 처리 된 파골 세포의 분화에 세포 독성없는 주목할 만한 억제를 보였다. SBH는 P38, JNK, I-κB의 인산화를 억제하였고, RANKL에 의한 c-Fos와 NFATc1의 유도를 하향 조절하였다. RRP와 CS는 I-κB의 분해를 억제하였으나, RANKL에 의한 c-Fos와 NFATc1에 영향을 끼치지 못하였다. 마지막으로, 생체 실험의 자료에서는 RRP와 SBH는 LPS 처치에 의한 뼈의 파괴를 방지하는 것으로 나타났다.
실험 결론 :따라서, 이러한 결과는 SBH은 골다공증과 같은 뼈 손실 질병에 대한 효과적인 치료법이 될 수 있음을 보여준다.
Purpose : The purposes of this study are to find out whether the water extract of Rehmanniae Radix Preparat(RRP), Cuscutae Semen(CS) and their combination (Ssangbo-hwan, SBH) has the effect of suppressing the RANKL-induced osteoclast differentiation. Also to find out whether the water extract of RRP, CS and SBH has the effect of inhibiting osteoporosis in osteoporosis model induced by lipopolysaccharide(LPS).
Method : After promoting differentiation of osteoclasts by treating the RANKL,?we observed the effect by the administration of RRP, CS and SBH. In addition, by means of RT-PCR, we assayed mRNA expression levels of NFATc1, c-Fos, TRAP and GAPDHS from bone marrow macrophages(BMMs). Similarly, the protein expression levels of NFATc1, C-Fos, MAPKs and β-actin in cell lysates were analyzed by means of Western Blotting. Then, we determined the anti-osteoporotic effects of RRP, CS and SBH, through the use of Lipopolysaccharide (LPS)-induced bone-loss mouse.
Results : RRP, CS and SBH showed remarkable inhibitive effect on RANKL-treated osteoclast differentiation without cytotoxicity. SBH inhibited the phosphorylation of P38, JNK, and I-κB and down-regulated the induction of c-Fos and NFATc1 by RANKL. RRP and CS suppressed degradation of I-κB, but they did not affect c-Fos and NFATc1 by RANKL. Lastly, in vivo date showed that RRP and SBH prevented the bone erosion by LPS treatment.
Conclusion : Thus, these results demonstrate SBH can be effective remedies for bone-loss diseases such as osteoporosis.
목차
Ⅰ. 緖 論 1Ⅱ. 재료 및 방법 31. 재료1) 시약 32. 방법 31) 약물의 추출 및 제조 32) 파골세포 배양 및 분화 억제 43) 독성검사 44) Western Blot Analysis 55) 역전사 중합반응 (RT-PCR) 분석 56) 동물실험 67) 통계분석 7Ⅲ. 실험 결과 81. 파골세포 분화 억제 효과 81) 쌍보환 추출물이 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화에 미치는 영향 82) 숙지황 추출물, 토사자 추출물이 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화에 미치는 영향 102. 쌍보환, 숙지황, 토사자 물 추출물의 세포독성 123. RANKL에 의한 파골세포 유도인자 발현 억제효과 141) 쌍보환 추출물이 RANKL에 의한 유전자 발현에 미치는 효과 142) 숙지황 추출물, 토사자 추출물이 RANKL에 의한 유전자 발현에 미치는 효과 164. RANKL에 의해 유도되는 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현 억제 효과 181) 쌍보환 추출물이 RANKL로 유도되는 c-Fos와 NFATc1 발현에 미치는 효과 182) 숙지황 추출물, 토사자 추출물이 RANKL에 의해 유도되는 c-Fos와 NFATc1 발현에 미치는 효과 205. 파골세포 분화의 신호전달 경로에 미치는 효과 221) 쌍보환 추출물이 RANKL로 유도되는 뼈 파골세포 분화의 신호전달 경로 에 미치는 효과 222) 숙지황 추출물, 토사자 추출물이 RANKL로 유도되는 뼈 파골세포 분화 의 신호전달 경로에 미치는 효과 246. LPS-유도 골 손실에 미치는 효과 26Ⅳ. 考 察 29Ⅴ. 結 論 35