UHPLC-DAD를 이용한 불환금정기산의 다성분 동시분석법 개발 및 밸리데이션 :Method Validation and Simultaneous Determination for Marker Components of Bulhwangeumjeonggisan by UHPLC-DAD

이경희

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자료유형: 학위논문

저자정보: 이경희 (원광대학교, 원광대학교 대학원)

지도교수: 정현주

발행연도: 2015

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이 논문의 연구 히스토리 (2)

2016

UPLC-DAD를 이용한 불환금정기산의 다성분 동시분석법 개발

이경희 , 라미차네라마칸타 , 서르마디박쿠마르 외 3명 생약학회지(Korean Journal of Pharmacognosy) 2016.12 학술저널

2015

UHPLC-DAD를 이용한 불환금정기산의 다성분 동시분석법 개발 및 밸리데이션

이경희 한약 2015.01 학위논문

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불환금정기산은 전통적인 한약제제로 상한음증으로 인한 감기증세, 위장 질환 등에 사용해왔으며, 창출, 후박, 진피, 감초, 곽향, 반하, 생강, 대추로 구성되어있다. 대한약전에 따르면 불환금정기산은 진피의 hesperidin, 감초의 glycyrrhizin만이 지표성분으로 설정되어 있어, 이 두 가지의 성분만으로는 불환금정기산의 일관된 약효 유지 및 품질관리가 어려운 실정이다. 따라서 본 연구에서는 불환금정기산의 일관된 품질관리를 위하여 구성하는 모든 생약으로부터 지표성분을 설정하였고, 설정한 지표성분들에 대한 표준화를 진행하고자 UHPLC-DAD 분석법을 개발하였으며, 개발된 분석법의 타당성을 입증하기 위해 밸리데이션을 수행하였다. 분석법에 사용된 컬럼은 RP-Amide (2.7 μm, 4.6 mm × 150 mm)이며, 이동상으로는 0.1% phosphoric acid, acetonitrile을 사용하였으며 Diode array detector를 사용하여 지표성분이 잘 검출될 수 있는 210, 325 nm의 파장을 선택하였다. 분석법의 타당성을 확인하기 위하여 직선성, 정밀성, 정확성, 검출한계, 정량한계, 농도의 범위를 파라미터로 사용하여 밸리데이션을 수행하였다. 직선성은 회귀방정식과 검량선을 구하는 것으로 평가하였고, R2의 값이 0.9994 이상으로 나타났다. 지표성분들의 검출한계와 정량한계는 각각 0.011-0.091 μg/ml, 0.034-0.277 μg/ml의 범위로 측정되었다. 일간, 일내 정밀성 평가의 경우 상대표준편차(RSD)의 값이 모두 3.61%이하, 반복성 평가의 경우 0.68% 이하로 나타났다. 정확성은 회수율을 측정하는 것으로 평가하였으며, 94.4-107.9%의 범위 안으로 측정되었고, 상대표준편차는 모두 4.6% 이하로 나타났다. 또한 시판되는 제제를 구입하여 실험실에서 제조한 혼합단미엑스산과 함께 지표성분의 함량을 측정해본 결과, 각각의 지표성분의 함량이 실험실에서 제조한 혼합단미엑스산에서는 7.521-72.237 mg/g의 범위로 측정되었으나, A사 제제에서는 guanosine은 검출되지 않았고 다른 지표성분의 함량은 0.370-50.313 mg/g의 범위로 나타났다. B사의 제제에서는 hesperidin 32.557 mg/g, glycyrrhizin 19.066 mg/g만이 검출되었으며 다른 지표성분은 검출되지 않았다.

Bulhwangeumjeonggisan (BHGJGS) is a traditional herbal formulation used in cold and sometimes gastric disease. BHGJGS constitutes extracts of eight herbal plants; Atractylodis rhizoma, Magnoliae cortex, Citri Pericapium, Glycyrrhizae Radix, Agastachis Herba, Pinelliae Rhizoma, Zingiberis Rhizoma and Zizyphi Fructus. Accoding to KP (Korean Pharmacopeia), only two plants; Citri Pericapium and Glycyrrhizae Radix were standadized in BHGJGS. So establishment of new method is necessary for standardization other plants. A simple and accurate method using ultra high performance liquid chromatography-diode array detector (UHPLC-DAD) was developed and validated for standardization of BHGJGS. UHPLC conditions were optimized using a RP-Amide column (2.7 μm, 4.6 mm × 150 mm) and mobile phase; 0.1% phosphoric acid and acetonitrile. The detection wavelength was set at 210 and 325 nm. The method validation was evaluated by some validation parameters; such as linearity, precision and accuracy. Lenearity of each marker compounds showed good results (R2 >0.9994). The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were within the ranges of 0.011-0.091 μg/ml and 0.034-0.277 μg/ml, respectively. The relative standard deviation (RSD) of intra- and inter-day precision were below 3.61%. The RSD of repeatability was below 0.68%. The results of recovery test were within the ranges of 94.4-107.9%, and the maximum value of RSD was 4.6%. The developed method was also used to evaluate the quality of two commercial formulations. The contents of BHGJGS mix extract powder were ranges of 7.5-72.2 mg/g, commecial formulation of pharmaceutical company A were ranges of 0.4-50.3 mg/g, but in this formulation, guanosine was not detected. Only two compounds were detected in the commercial formulation of pharmaceutical company B, hesperidin 32.6 mg/g and glycyrrhizin 19.1 mg/g. According to these data, the developed method was specific, sensitive, accurate and precise for analysis components of BHGJGS.

Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 재료 및 방법 5
1. 불환금정기산 5
2. 시약 및 기기 5
3. 실험방법 6
3.1 분석용 시료 및 표준품 제조 6
3.2. 분석법 밸리데이션 (Method validation) 6
3.2.1. 특이성 (Specificity) 6
3.2.2. 직선성 (Linearity) 7
3.2.3. 검출한계 (Limit of detection) 7
3.2.4. 정량한계 (Limit of quantification) 7
3.2.5. 정밀성 (Precision) 7
3.2.6. 정확성 (Accuracy) 8
3.2.7. 범위 (Range) 8
3.3 함량평가 8
Ⅲ. 결과 9
1. 분석법 개발 9
1.1. 분석 조건 최적화 9
1.2. 농도 범위 설정 9
2. 분석법 밸리데이션 11
2.1. 특이성 11
2.2. 직선성, 검출한계 및 정량한계 14
2.3. 정밀성 16
2.4. 정확성 18
2.5. 함량분석 19
Ⅳ. 고찰 21

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