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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 황경숙
- 발행연도
- 2015
- 저작권
- 목원대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수5
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생명산업분야에 널리 활용되고 있는 방선균 유전자원 다양성 확보를 위하여 차세대 분자기법인 pyrosequencing 염기서열 해석을 통하여 대나무 군락지 내에 분포하는 방선균 군집의 계통학적 다양성을 검토하고 분리된 방선균의 분류학적 특성을 조사함과 동시에 다상분류법에 의거하여 신종 방선균의 분류·동정을 수행하였다.
국내 자생하는 왕대, 분죽, 조릿대, 호마죽과 같은 다양한 대나무 군락지의 낙엽층 및 근권토양 내에 분포하는 방선균 밀도를 측정한 결과 2.7×106~2.7×108 CFU/g로 계수되었다. 특히, 조릿대 대나무 군락지의 낙엽층 내에는 2.7×108 CFU/g로 본 연구에서 조사한 다양한 토양에 비해 10~100배 이상의 높은 밀도를 나타내었다.
조릿대 대나무 군락지 내 방선균 군집의 계통 해석을 위해 454 pyrosequencing 기법으로 염기서열을 분석한 결과, 6목(目) 36과(科) 121속(屬)을 포함하는 다양한 방선균이 분포해 있음을 확인하였다. 방선균 군집 중 Actinomycetales 목에 속하는 계통군이 전체의 80% 이상 높은 분포율을 나타내었다. 우점 방선균군인 Actinomycetales 목에 속하는 방선균은 26과 111속으로 분류되었다.
조릿대 대나무 군락지 내에 분포하는 다양한 방선균을 분리하기 위해 방선균 분리법에 널리 이용되고 있는 매뉴얼법에 따라 총 200균주를 분리하고 방선균 콜로니형태(기균사, 기중균사, 수용성 색소)를 관찰한 결과, 25개 type의 방선균 콜로니 형태그룹으로 분류되었다. 이들 분리균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 해석 결과, 모든 균주가 Streptomyces 속에 속하는 방선균으로 나타났다.
다양한 방선균 확보를 위해 토양시료를 습열(55℃, 65℃)전처리 한 후, 4종류의 다양한 배지를 사용하고 배양기간 및 배양조건 등을 고려하여 총 300균주를 분리한 결과, 45개 type의 방선균 콜로니 형태그룹으로 분류되었다. 이들 분리균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 해석 결과, Asanoa, Actinomadura, Catenulispora, Dactylosporangium, Gordonia, Kibbella, Microbispora, Micromonospora, Nonomuraea 그리고 Streptomyces 속에 속하는 균주로 확인되었다. 이상, 상기의 비배양법에 의해 확인된 방선균 121속 중 개량화한 배양법으로 분리한 결과, 11 속이 성공적으로 분리되었다. 이들 분리된 11개 속 중 약 83%가 Streptomyces 속에 속하는 균주로, cluster I (20균주), cluster II (294균주), cluster III (102균주) 그리고 cluster IV (56균주)로 세분류되었다.
본 연구를 통해서 분리된 방선균 총 500균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 해석 결과, 11속(屬) 56종(種)의 다양한 방선균 중 근연종과 98.7% 이하의 상동성을 나타내는 신종 방선균 20균주가 선발되었다. 이들 신종 방선균은 다상분류법에 의거하여 동정하였으며 국제미생물분류학회지(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, IJSEM)에 게재하였다.
신종 방선균 Streptomyces gramineus JR-43T (=KACC 15079T =NBRC 107863T), Catunulispora graminis BR-34T (=KACC 15070T =NBRC 107755T), Streptomyces graminilatus JL-6T (=KACC 16470T =NBRC 108882T), Streptomyces graminisoli JR-19T (=KACC 16472T =NBRC 108883T), Streptomyces rhizophilus JR-41T (=KACC 16580T =NBRC 108885T) 그리고 Streptomyces graminifolii JL-22T (=KACC 17180T =NBRC 109806T)는 국내 농업유전자원센터(KACC)와 일본 Biological Resources Center, Nite (NBRC)에 기탁·등록되었으며, 향후 생명연구자원으로 활용될 것으로 기대한다.
국내 자생하는 왕대, 분죽, 조릿대, 호마죽과 같은 다양한 대나무 군락지의 낙엽층 및 근권토양 내에 분포하는 방선균 밀도를 측정한 결과 2.7×106~2.7×108 CFU/g로 계수되었다. 특히, 조릿대 대나무 군락지의 낙엽층 내에는 2.7×108 CFU/g로 본 연구에서 조사한 다양한 토양에 비해 10~100배 이상의 높은 밀도를 나타내었다.
조릿대 대나무 군락지 내 방선균 군집의 계통 해석을 위해 454 pyrosequencing 기법으로 염기서열을 분석한 결과, 6목(目) 36과(科) 121속(屬)을 포함하는 다양한 방선균이 분포해 있음을 확인하였다. 방선균 군집 중 Actinomycetales 목에 속하는 계통군이 전체의 80% 이상 높은 분포율을 나타내었다. 우점 방선균군인 Actinomycetales 목에 속하는 방선균은 26과 111속으로 분류되었다.
조릿대 대나무 군락지 내에 분포하는 다양한 방선균을 분리하기 위해 방선균 분리법에 널리 이용되고 있는 매뉴얼법에 따라 총 200균주를 분리하고 방선균 콜로니형태(기균사, 기중균사, 수용성 색소)를 관찰한 결과, 25개 type의 방선균 콜로니 형태그룹으로 분류되었다. 이들 분리균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 해석 결과, 모든 균주가 Streptomyces 속에 속하는 방선균으로 나타났다.
다양한 방선균 확보를 위해 토양시료를 습열(55℃, 65℃)전처리 한 후, 4종류의 다양한 배지를 사용하고 배양기간 및 배양조건 등을 고려하여 총 300균주를 분리한 결과, 45개 type의 방선균 콜로니 형태그룹으로 분류되었다. 이들 분리균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 해석 결과, Asanoa, Actinomadura, Catenulispora, Dactylosporangium, Gordonia, Kibbella, Microbispora, Micromonospora, Nonomuraea 그리고 Streptomyces 속에 속하는 균주로 확인되었다. 이상, 상기의 비배양법에 의해 확인된 방선균 121속 중 개량화한 배양법으로 분리한 결과, 11 속이 성공적으로 분리되었다. 이들 분리된 11개 속 중 약 83%가 Streptomyces 속에 속하는 균주로, cluster I (20균주), cluster II (294균주), cluster III (102균주) 그리고 cluster IV (56균주)로 세분류되었다.
본 연구를 통해서 분리된 방선균 총 500균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 해석 결과, 11속(屬) 56종(種)의 다양한 방선균 중 근연종과 98.7% 이하의 상동성을 나타내는 신종 방선균 20균주가 선발되었다. 이들 신종 방선균은 다상분류법에 의거하여 동정하였으며 국제미생물분류학회지(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, IJSEM)에 게재하였다.
신종 방선균 Streptomyces gramineus JR-43T (=KACC 15079T =NBRC 107863T), Catunulispora graminis BR-34T (=KACC 15070T =NBRC 107755T), Streptomyces graminilatus JL-6T (=KACC 16470T =NBRC 108882T), Streptomyces graminisoli JR-19T (=KACC 16472T =NBRC 108883T), Streptomyces rhizophilus JR-41T (=KACC 16580T =NBRC 108885T) 그리고 Streptomyces graminifolii JL-22T (=KACC 17180T =NBRC 109806T)는 국내 농업유전자원센터(KACC)와 일본 Biological Resources Center, Nite (NBRC)에 기탁·등록되었으며, 향후 생명연구자원으로 활용될 것으로 기대한다.
목차
Ⅰ. 서 론 4Ⅱ. 재료 및 방법 81. 대나무 군락지 시료 채취 82. 방선균 계수 및 분리 9(1) 매뉴얼법을 이용한 방선균 계수 및 분리 9(2) 토양시료 습윤(55℃, 65℃)처리법을 이용한 방선균 계수 및 분리 93. 조릿대 대나무 군락지 내 방선균 군집의 계통 해석 10(1) 토양 DNA 추출 101) Rapid법을 이용한 토양 DNA 추출 102) ISOIL Kit를 이용한 토양 DNA 추출 113) Lysis (SDS, lysozyme, sonication vortex)처리에 의한 토양 DNA 추출 12(2) 16S rRNA 유전자 PCR 증폭 및 pyrosequencing 13(3) 16S rRNA 유전자 pyrosequencing 및 세균 군집 구조 해석 134. 다상분류법에 의거한 방선균의 분류·동정 14(1) 방선균 콜로니 형태학적 특성 14(2) 주사현미경(SEM)을 이용한 세포형태학적 특성 14(3) 생리·생화학적 특성 15(4) 16S rRNA 유전자 PCR 증폭 및 정제 15(5) 분리된 방선균의 계통도작성 16(6) 균체지방산 조성 분석 16(7) Quinone 분석 16(8) Polar lipid 분석 17(9) 방선균 DNA 추출 18(10) G+C 함량 분석 18(11) Diaminopimelic acid 분석 19(12) Whole-cell sugar 분석 19(13) DNA-DNA hybridization 20Ⅲ. 결과 및 고찰 21제 1장 대나무 군락지 내 방선균 군집의 계통학적 다양성 211. 대나무 군락지 내 방선균군의 밀도 측정 222. 조릿대(Sasa borealis) 대나무 군락지 내 방선균 군집 계통 해석 23(1) 토양시료로부터 DNA 추출 및 16S rRNA 유전자 PCR 증폭 23(2) 조릿대(Sasa borealis) 대나무 군락지 내 세균 군집의 계통 해석 26(3) 조릿대(Sasa borealis) 산림토양 내 Actinobacteria 계통군의 특성 301) 조릿대(Sasa borealis) 낙엽층 시료 내 Actinobacteria 계통군의 특성 302) 조릿대(Sasa borealis) 근권토양 시료 내 Actinobacteria 계통군의 특성 32제 2장 조릿대(Sasa borealis) 대나무 군락지로부터 다양한 방선균 분리 및 계통 해석 371. 매뉴얼법에 의한 방선균 분리 및 계통 해석 37(1) 매뉴얼법에 의한 방선균 분리 37(2) 매뉴얼법에 의해 분리된 방선균의 콜로니 형태분류 39(3) 매뉴얼법에 의해 분리된 방선균의 계통 해석 412. 토양시료의 습열처리에 의한 방선균 분리 및 계통 해석 45(1) 배양배지 45(2) 토양시료 습열(55℃)전처리에 의한 방선균 분리 및 계통 해석 471) 방선균 분리 472) 분리된 방선균 콜로니 형태분류 483) 분리된 방선균의 계통 해석 50(3) 토양시료 습열(65℃)전처리에 의한 방선균 분리 및 계통 해석 541) 방선균 분리 542) 분리된 방선균 콜로니 형태분류 553) 분리된 방선균 군집의 계통 해석 583. 조릿대 대나무 군락지로부터 방선균 다양성 확보 64(1) 조릿대 대나무 군락지로부터 분리된 방선균 특성 641) 기균사를 형성하지 않는 방선균 다양성 642) 회색의 기균사를 형성하는 방선균 다양성 663) 흰색 기균사를 형성하는 방선균 콜로니 다양성 684) 기타 다른 색의 기균사를 형성하는 방선균 콜로니 다양성 69(2) 조릿대 대나무 군락지로부터 분리된 다양한 방선균의 계통학적 다양성 70(3) 조릿대 대나무 군락지로부터 분리된 방선균의 분류학적 특성 711) Gordoniaceae 科에 속하는 방선균 71① 형태학적 특성 71② 16S rRNA 유전자 염기서열의 계통학적 위치 712) Micromonosporaceae 科에 속하는 방선균 73① 형태학적 특성 73② 16S rRNA 유전자 염기서열의 계통학적 위치 753) Mycobacteriaceae 科에 속하는 방선균 78① 형태학적 특성 78② 16S rRNA 유전자 염기서열의 계통학적 위치 794) Nocardioidaceae 科에 속하는 방선균 80① 형태학적 특성 80② 16S rRNA 유전자 염기서열의 계통학적 위치 815) Streptomycetaceae 科에 계통학적 분류 82① 형태학적 특성 82② 16S rRNA 유전자 염기서열의 계통학적 위치 846) Streptosporangiaceae 科에 계통학적 분류 87① 형태학적 특성 87② 16S rRNA 유전자 염기서열의 계통학적 위치 887) Thermomonosporaceae 科에 계통학적 분류 90① 형태학적 특성 90② 16S rRNA 유전자 염기서열의 계통학적 위치 914. 비배양법과 배양법을 이용한 조릿대 대나무 군락지 내 방선균 군집의 계통학적 다양성 비교 92제 3장 다상분류법에 의거한 신종 방선균의 분류·동정 941. Streptomyces gramineus sp. nov. JR-43T 및 JR-4 균주 96(1) 형태적 특성 961) 콜로니 형태학적 특성 962) 세포 형태학적 특성 99(2) 16S rRNA 유전자 염기서열의 계통학적 위치 100(3) 생리·생화학적 특성 101(4) 화학적 특성 1031) 균체지방산 분석(Cellular fatty acid) 1032) Quinone 종 분석 1043) Polar lipid 분석 1054) G+C 함량 분석 1065) Diaminopimelic acid 분석 1076) Whole-cell sugar 분석 107(5) DNA-DNA hybridization 108(6) Description of Streptomyces gramineus sp. nov. 1092. Catenulispora graminis sp. nov. BR-34T 균주 110(1) 형태적 특성 1101) 콜로니 형태학적 특성 1102) 세포 형태학적 특성 112(2) 16S rRNA 유전자 염기서열의 계통학적 위치 113(3) 생리·생화학적 특성 114(4) 화학적 특성 1171) 균체지방산 분석(Cellular fatty acid) 1172) Quinone 종 분석 1193) Polar lipid 분석 1204) G+C 함량 분석 1215) Diaminopimelic acid 분석 1226) Who
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