정원줄기세포에 대한 연구는 남성 불임 치료에 적용함에 있어 반드시 필요하다. 오늘 날까지 정원줄기세포에 대해서 많은 연구가 이뤄지고 있지만, mouse나 rat과 같이 다루기 쉬운 설치류에 대한 정원줄기세포 연구가 주로 보고되고 있다. 설치류를 제외한 다른 동물의 경우, 어떤 기술이 그 동물의 정소로부터 정원줄기세포를 분리하는 것에 있어서 효율적인 방법인지는 잘 알려지지 않았다. 체외 배양에서 줄기세포의 특성인 자가 재생과 미분화 상태를 유지하기 위한 정원줄기세포 배양 조건 또한 잘 알려지지 않았다. 비록 최근 몇 년 전부터 여러 가지 분리 방법 및 배양 조건을 이용한 몇몇 방법들이 돼지 정원줄기세포 확립에 이용되어 왔지만, 돼지 정원줄기세포 확립을 위한 최적화된 시스템은 아직 개발되지 않았다. 이러한 기초 연구에 대한 부족으로, 가장 먼저 돼지 정소로부터 정원줄기세포를 효과적으로 분리하는 기법에 대해서 연구할 필요가 있으며, 체외 배양 시스템 하에서 돼지 정원줄기세포의 유지를 최적화하기 위한 표준 방법을 확립할 필요가 있다.

따라서 돼지 정원줄기세포의 더욱 더 향상된 배양 시스템을 개발하기 위해, 1장에서 정원줄기세포만을 회수할 수 있는 효율적인 기술을 개발했다. 또한, 2장과 3장에서 이렇게 분리된 돼지 정원줄기세포의 배양을 위한 효과적인 방법을 확립했다. 돼지 정원줄기세포 회수 시스템과 효과적인 배양 방법 개발에 관한 연구는 AP 활성, 정원줄기세포 특이적 유전자의 발현 등을 평가함으로써 수행되었다.

CHAPTER 1
: 돼지 정소로부터 정원줄기세포를 분리하기 위한 높은 비율의 회수 기술 개발에 대한 연구

지금까지 돼지 정소 세포로부터 정원줄기세포를 분리하기 위해 이용 가능한 방법은 낮은 효율을 가지고 있다. 그러므로 우리는 높은 비율의 세포 분리 능력을 가진 새로운 분리 기술 개발을 시도했다. 우리는 신생아 돼지 정소에서 유래된 정소 세포에서 AP 활성과 정원줄기세포 특이적 유전자 발현을 측정함으로써 정원줄기세포의 존재를 확인하였다. 그 다음으로, 정소 세포로부터 정원줄기세포의 분리는 DP, double DP, Petri dish plating post DP, MACS와 MACS post-DP 등의 서로 다른 기술을 사용하면서 수행되었다. AP 염색법은 각각의 방법의 분리 효율을 평가하고 비교하는데 이용됐다. 결과적으로, Petri dish plating post-예는 가장 높은 분리 효율을 야기했다. 이 방법으로 분리된 추정의 정원줄기세포는 정원줄기세포 특이적 유전자와 이와 관련된 단백질, 생식세포 특이적 유전자의 발현을 분석함으로써 특징지어졌다. OCT4, NANOG, EPCAM, THY1과 UCHL1은 전사적으로 발현되었고, OCT4, NANOG, SOX2, TRA-1-60, TRA-1-81과 PLZF은 번역적으로 분리된 정원줄기세포의 86% 정도 발현되었다. 그에 반해서, 정원줄기세포와 negative control세포 사이에서 Leydig cell 특이 단백질인 LHR 또는 Sertoli cell 특이 단백질인 GATA4를 발현하는 세포의 비율은 차이점이 없었다. 게다가, 원시생식세포의 특이적 마커인 VASA와 분열 전 생식세포 특이적 마커인 DAZL의 전사적 발현은 상대적으로 발견되지 않았다. 우리는 미래의 돼지 정원줄기세포와 관련된 연구를 가능케 하는 돼지 정소로부터 정원줄기세포를 분리하기 위한 새로운 높은 효율의 기술을 성공적으로 개발했다.

CHAPTER 2
: 신생아 돼지 정소로부터 유래된 정원줄기세포의 단기간 배양을 지지하는 니쉬 조건에 대한 연구

특정 인간 질병의 경제적 형질 또는 표현형을 높은 성능을 가진 돼지로부터 유래된 돼지 정원줄기세포는 끊임없이 유전적 배경을 보존하기 위한 실용적인 도구로써 여겨져 왔지만, 돼지 정원줄기세포의 증식과 유지를 촉진하는 니쉬 조건의 정확한 정의에 대한 보고가 없었다. 따라서, 우리는 단기간 동안 미분화되지 않은 돼지 정원줄기세포의 증식과 유지를 도와주는 니쉬 조건을 결정했다. 이러한 이유로 미분화된 돼지 정원줄기세포는 배양액의 서로 다른 성분, 배양접시에 뿌려지는 정원줄기세포의 수, 다양한 배양보조세포(피더세포)의 우형과 성장인자의 농도에서 꾸준히 계속해서 배양되었다. 그리고 난 후, 돼지 정원줄기세포의 전체 세포 수와 AP 활성은 배양 6일 후 조사되었다. 결과적으로 4 × 105개의 돼지 정원줄기세포가 유사분열이 불활성화된 2 × 105개의 STO 세포 위에서 30 ng/ml의 GDNF가 첨가된 mESCCM으로 배양되는 것이 단기간 동안 돼지 정원줄기세포의 미분화 유지를 도와주는 가장 효과적인 배양 시스템이라는 것을 증명했다. 더구나 이렇게 최적화된 단기간 배양 시스템은 미래의 연구에서 정원줄기세포의 장기간 배양 시스템을 개발하는 데 적용할 수 있을 것이다.

CHAPTER 3
: 신생아 돼지 정소로부터 유래된 정원줄기세포의 증식과 미분화를 위한 부유 배양 시스템의 효과에 대한 연구

돼지 정원줄기세포의 체외 배양과 관련된 많은 연구에도 불구하고, 부착 배양 방법은 돼지 정원줄기세포의 자가 재생 유지에 있어서 제한을 보여주고 있다. 그러므로, 이러한 문제를 해결하기 위해서 부착 배양 이상의 수많은 장점을 가진 부유 배양 방법은 돼지 정원줄기세포의 배양에 적용되었다. 신생아 정소로부터 파생된 돼지 정원줄기세포는 5일 또는 20일 동안 부유 배양되었다. 이렇게 부유 배양된 돼지 정원줄기세포의 특징은 증식, AP 활성과 자가 재생 특이적 유전자 발현에 대해서 조사되었고, 이러한 결과는 부착 배양된 돼지 정원줄기세포의 특징과 비교되었다. 그 결과에 따라, 부유 배양된 돼지 정원줄기세포는 완전히 증식되지 않았고, 부착 배양된 돼지 정원줄기세포보다 AP 활성과 자가 재생 특이적 유전자의 발현에 있어서는 유의적으로 높은 비율을 보였다. 게다가 부유 배양 조건 하에서 돼지 정원줄기세포의 장기간 배양이 이뤄졌는데, 배양 10일 이후부터 AP 활성은 유의적으로 감소되었다. 이러한 결과들은 부유 배양 시스템이 돼지 정원줄기세포를 단기간 배양하는데 있어서, 돼지 정원줄기세포의 증식과 AP 활성을 유지하는데 효과적인 방법임을 보여줬다.

Research on SSCs and their use in the treatment of male infertility is essential. Although many studies of SSCs have been performed, most of them have focused on SSCs from rodents, including mice and rats. Techniques for isolating SSCs from non-rodent testes are currently unavailable. In addition, the necessary conditions for the self-renewal of and maintenance of an undifferentiated state in in vitro-cultured SSCs remain unclear. Various isolation methods and culture conditions have been used to establish porcine SSCs; however, an optimized system has not yet been developed. Given these limitations, it is important to explore an efficient technique for SSC isolation from porcine testis and to establish a standardized procedure for the maintenance of porcine SSCs using an in vitro culture system.

CHAPTER 1
: Development of a High-yield Technique to Isolate Spermatogonial Stem Cells from Porcine Testes

To date, the methods available for isolating SSCs from porcine testicular cells have a low efficiency of cell separating. Therefore, we tried to develop a novel isolation technique with a high-yield cell separating ability to isolate SSCs from porcine testes. We confirmed the presence of SSCs by measuring AP activity and SSC-specific gene expression in neonatal porcine testis-derived testicular cells. Subsequently, the isolation of SSCs from testicular cells was performed using different techniques as follows: DP, double DP, Petri dish plating post-DP, MACS, and MACS post-DP. Positive AP staining was used to assess and compare the isolation efficiency of each method. Petri dish plating post-DP resulted in the highest isolation efficiency. The putative SSCs isolated using this method was then further characterized by analyzing the expression of SSC-specific genes and -related proteins, and germ cell-specific genes. OCT4, NANOG, EPCAM, THY1, and UCHL1 were expressed transcriptionally, and OCT4, NANOG, SOX2, TRA-1-60, TRA-1-81, and PLZF were expressed transnationally in 86% of the isolated SSCs. In contrast, no difference was observed in the percentage of cells expressing LHR, a Leydig cell-specific protein, or GATA4, a Sertoli cell-specific protein, between SSCs and negative control cells. In addition, transcriptional expression of VASA, a primordial germ cell-specific marker, and DAZL, a premeiotic germ cell-specific marker, wasn’t and was detected, respectively. We successfully developed a novel high-yield technique to isolate SSCs from porcine testes to facilitate future porcine SSC-related research.

CHAPTER 2
: Identification of Niche Conditions Supporting Short-term Culture of Spermatogonial Stem Cells Derived from Porcine Neonatal Testis

Despite that pSSCs have been regarded as a practical tool for preserving eternally genetic backgrounds derived from pigs with high performance in the economic traits or phenotypes of specific human diseases, there were no reports about precise definition of niche conditions promoting proliferation and maintenance of pSSCs. Accordingly, we tried to determine niche conditions supporting proliferation and maintenance of undifferentiated pSSCs for short-term. For these, undifferentiated pSSCs were progressively cultured in different composition of culture medium, seeding density of pSSCs, type of feeder cells and concentration of growth factors, and then total number of and AP activity of pSSCs were investigated at post 6 days culture. As the results, the culture of 4 × 105 pSSCs on mitotically in activated 2 × 105 STO cells in the mESCCM supplemented with 30 ng/ml GDNF was identified as the best niche condition supporting effectively the short-term maintenance of undifferentiated pSSCs. Moreover, the optimized short-term culture system will be a basis for developing long-term culture system of pSSCs in the following researches.

CHAPTER 3
: Effect of Suspension Culture on Proliferation and Undifferentiation of Spermatogonial Stem Cells Derived from Porcine Neonatal Testis

Despite many researches related with in vitro culture of porcine SSCs, adherent culture system widely used has shown a limitation in the maintenance of porcine SSC self-renewal. Therefore, in order to overcome this obstacle, suspension culture, which is known to have numerous advantage over adherent culture, was applied to the culture of porcine SSCs. Porcine SSCs retrieved from neonatal testes were suspension-cultured for 5 days or 20 days, and characteristics of suspension-cultured porcine SSCs including proliferation, AP activity, and self-renewal-specific gene expression were investigated and compared with those of adherent-cultured porcine SSCs. As the results, the suspension-cultured porcine SSCs showed entirely non-proliferative and significantly higher rate of AP-positive cells and expression of self-renewal-specific genes than the adherent-cultured porcine SSCs. In addition, long-term culture of porcine SSCs in suspension condition induced significant decrease in the yield of AP staining-positive cells on post-day 10 of culture. These results showed that suspension culture was inappropriate to culture porcine SSCs, because the culture of porcine SSCs in suspension condition didn’t stimulate proliferation and maintain AP activity of porcine SSCs, regardless of culture periods.