최근, 손상된 장기나 조직의 기능을 회복하거나 대체하여 생체 기능을 유지 및 복원을 하는 연구, 다시 말해 조직공학에 관한 연구가 많이 이루어지고 있다. 조직공학은 줄기세포, 성장인자 혹은 분화 인자, 세포와 재생 될 조직의 형태를 잡아줄 수 있는 스캐폴드, 이 세가지 요소가 핵심적인 파라미터이다. 본 연구에서는 스캐폴드에 해당하는 하이드로젤의 재료적 측면부터 접근을 하였고, 이를 이용하여 조직 재생 또는 질병치료에 응용하는 연구를 수행하였다. 하이드로젤은 그물망 구조를 가진 친수성 고분자로서, 물에는 녹지 않으면서 높은 수분 함유량을 지닌 물질이다. 하이드로젤은 다양한 생체재료와 다양한 반응을 이용하여 합성 가능하기 때문에 많은 연구자들의 연구목표가 되고 있다, 하지만 대부분의 재료가 생체 내 불확실성, 즉 장기적 생체독성 가능성 및 낮은 체내안정성과 같은 이유로 실질적으로 생체에 적용하기에는 한계가 있다. 체내에 천연적으로 존재하는 선형 다당류인 히알루론산 (HA)는 생분해 및 적합성, 무독성 등의 우수한 생물학적 특성을 가지고 있고 실질적으로 생체에 쓰일 수 있도록 허가 받은 물질이다. 본 연구에서는 HA를 이용해서 분해가 빨리 일어나거나 느리게 일어나도록 조절된 하이드로젤, 주사 가능형 하이드로젤 등 다양한 하이드로젤을 개발하는 연구를 수행하였다. HA 하이드로젤을 단순히 재료만 생체에 적용한 필러 제형부터 손상조직을 근본적으로 치유할 수 있도록 설계된 세포치료복합체에 이르기까지 다양한 시스템에 적용을 하여 난치성 질병의 치료에 대한 연구를 체계적으로 수행하였다.
제 1장에서는 조직공학에 있어서 하이드로젤과 기존의 문제점에 대해서 기술하고 이를 해결하기 위한 연구계획에 대해 전체적으로 제시하였다.
제 2장에서는 분해가 천천히 일어나도록 조절된 HA 하이드로젤의 연조직 공학 적용에 대해서 기술하였다. 현재 Restylane®이라는 상품명의 HA 하이드로젤이 성형수술에 많이 사용되고 있는데 주름에 마이크로하이드로젤을 주사하여 tissue augmentation효과를 볼 수 있다. 하지만 HA 하이드로젤을 형성하는 반응이 완료되어도 가교제 한쪽이 반응하지 않고 남은 미반응 잔기가 남아 있으므로 반응성이 좋은 링커인 1,4-Butandiol glycidyl ether (BDDE)를 사용한 Restylane®과 Divinylsulfone (DVS)를 사용한 Hylaform®의 경우 고반응성 가교제의 영향으로 민감한 피부를 가진 사람들에게 알러지반응과 염증 등의 부작용이 발생하는 경우도 있다. 또한 하이드록실기가 가교반응에 참여하였기 때문에 HA 하이드로젤의 분해가 빨리 일어나므로 치료효과를 유지하기 위해서는 6개월마다 시술해야 한다는 번거로움이 있다. 본 연구에서 개발한 HA-HMDA 하이드로젤은 생체에 안전하고, 분해가 느리게 일어나기 때문에 오랫동안 체내에서 유지 가능한 필러제형을 개발하였다. 주름이 형성된 마우스의 등에 하이드로젤을 투여한 결과, Restylane®과 차이 없이 주름 개선효과를 확인하였고, HA-HMDA 하이드로젤의 경우 Restylane®에 비해 3개월이 지난 상태에서도 주름개선효과가 유지되는 것을 확인 할 수 있었다. 하지만 피부 조직을 분석해본 결과 기존제품은 염증반응이 발생한 반면 HA-HMDA하이드로젤을 사용하였을 경우 피부가 정상 조직에 가깝게 회복된 것을 확인 할 수 있었다. 일반적으로 필러는 함몰조직의 대체물의 목적으로 사용되지만 링커의 간단한 변형만으로도 근본적으로 조직의 구조를 유지 및 수복을 유도 할 수 있는 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 현재 임상으로 사용 가능한 필러제형을 개발하는 연구가 진행되고 있다.
제 3장에서는 분해가 빨리 일어나도록 조절된 HA 하이드로젤의 경조직 공학 적용에 대해서 기술하였다. 뼈는 다양한 조직의 복합체로서 신체의 항상성에 의해 유지되고 있다. 하지만 큰 손상을 입었을 때 쉽게 회복하기 어렵다. 효과적인 골재생을 위해서는 적절한 골대체재를 이용하여 골재생을 유도하여야 한다. 일반적으로 골재생 초기단계에서 신생혈관이 생성되고 중간엽 줄기세포 (MSC)가 이동해 와서 골충진재와 결합한 다음, 골화가 진행되는 것으로 알려져 있다. 이를 위해 성장인자 (growth factor)를 투여하여 골재생을 유도하는 연구가 진행되고 있지만 그 과정이 복잡하고 외부 단백질에 의한 면역거부반응이 발생할 가능성이 있다. HA는 신생혈관의 생성을 컨트롤하고 작은 분자량으로 분해되었을 때 골 분화를 촉진시키는 것으로 알려져있다. 따라서 본 연구에서는 분해속도가 조절된 HA 하이드로젤을 이용한 골충진재를 개발하는 연구를 수행하였다. 또한 마이크로크기의 다공성 골대체제 (Megagen Synthetic Bone, MGSB) 를 우선 화학적 침전방법을 통해 준비를 하였다. 골결손부가 형성된 뉴질랜드 토끼의 머리뼈에 HA hydrogel/MGSB를 채워 넣어 시술한 결과, HA 하이드로젤/BIO-OSS®로 시술하였을때에 비해 효과적으로 골판이 형성되었고, 8주후에는 GBCP가 흡수되어 골조직으로 대체되는 것을 확인하였다. X-ray bioimaging을 이용하여 3D micron-scale로 골재생 형태를 관찰한 결과 재생 된 골과 GBCP가 완벽하게 연결이 되었고 골화가 진행된 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 연구결과를 바탕으로 현재 차세대 골충진 복합체의 제품화를 위한 개발이 진행되고 있다.
제 4장에서는 주사가능형 하이드르로젤을 이용한 세포치료제에 대해 기술하였다. 세포치료제란 세포를 체외에서 증식시켜 손상을 입은 조직이나 질병을 치료하기 위한 목적으로 사용되는 치료제이다. 세포치료제는 치료효율을 높이기 위해 줄기세포, 유전자를 조작한 세포 등을 이용하기도 한다. 하지만 세포만을 주입하면 면역반응이나 체내 장기에 의한 clearance때문에 체내에서의 불안정성 및 낮은 치료효율을 의 단점을 지닌다. 이를 보완하기 위해 엄청난 양의 세포를 사용하기도 하고 세포를 코팅하거나 하이드로젤을 이용하는 등 세포를 보존하여 그 기능을 유지하려는 연구가 많이 이루어지고 있다. 하지만 기존 하이드로젤들은 화학적으로 결합하여 만든 하이드로젤은 강도가 강하지만 반응성이 좋은 반응기를 사용하기 때문에 독성측면에서 문제가 있고 물리적으로 만든 하이드로젤은 강도가 약해진다는 문제점이 있다. 따라서 이를 해결하기 위해 화학적 반응과 비슷한 강도를 지니지만 반응에 의한 독성이 발생하지 않는 하이드로젤이 필요하였다. 선행연구에서 CB[6]와 폴리아민과의 호스트-게스트반응을 이용한 HA 하이드로젤을 개발하는 연구를 하였고 이를 이용하여 세포치료제를 개발하는 연구를 수행하였으나 물에 녹지 않는 형태의 CB[6]를 사용하였기에 컨트롤이 쉽지 않았다. 본 연구에서 개발된 세포치료제는 물에 녹는 형태의 CB[6]를 이용하여 주사가능형 HA 하이드로젤을 개발하였고, 이를 통해 세포의 보존을 용이하게 하였다. 또한 오랜 시간의 세포 보존의 이점을 살리기 위해 아데노바이러스를 이용하여 중간엽 줄기세포를 변형하여 질병 관련 치료 물질이 발현되는 세포를 이용하여 효과를 높이려 하였다. 하지만 아데노바이러스는 세포를 감염시킨 후 핵과 결합하지 않기 때문에 유전자가 금방 사라지면서 치료 물질의 발현이 지속되지 않는다는 단점이 있다. 따라서 유전자 전사 활성 유도인자를 HA 하이드로젤에 도입하여 in vitro와 in vivo 모두 유전자의 발현이 높아지고 효과적으로 지속될 수 있도록 유도 할 수 있었다. 실질적인 질병 모델에 적용을 할 수 있는지 확인하기 위해, C57BL/6마우스에 흑색종의 한 종류인 멜라노마를 유도하였고 면역반응을 매개로 하는 사이토카인인 interleukin-12 (IL-12)를 발현하도록 하여 항암효과를 확인을 하였다. 현재 이 세포치료제 시스템은 줄기세포에 다양한 유전자의 도입을 통해 하지허혈증, 뇌졸중, 중추신경계 문제를 효과적으로 해결하기 위한 연구를 수행 및 계획하고 있다.

Tissue engineering (TE) is the term for the use of cells, physico-chemical factors, and engineered scaffolds to improve or replace biological functions in the body. Recently, it becomes very important to develop tissue engineering scaffolds to biomimic the nanoenvironment of 3 dimensional (3D) ECM in the body. A variety of synthetic scaffolds have been developed for tissue engineering applications including hydrogels, polymer meshes, and nanofibers. As an artificial ECM, synthetic scaffolds should have adequate mechanical properties, porous structures for free diffusion of nutrients and wastes, degradability in accordance with cellular growth, and easy fabrication process without cell damage and cytotoxic byproducts. Especially, hydrogels, 3D polymeric networks, have been widely investigated as highly promising artificial ECMs for in vitro and in vivo tissue engineering applications. Here, we developed hyaluronic acid (HA) hydrogels for the applications to cell therapy and tissue regeneration. HA is a biodegradable, biocompatible, non-immunogenic and natural linear polysaccharide in the body. Due to its excellent biological and physicochemical properties, HA has been widely used for various biomedical applications.
In chapter 1, overall introduction about the issues and problems of tissue engineering was described with my research outline in my Ph.D. thesis.
In chapter 2, a biocompatible and non-toxic dermal filler using HA hydrogels was successfully developed for tissue augmentation applications. Instead of using highly reactive crosslinkers such as divinylsulfone (DVS) for Hylaform®, 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) for Restylane®, and 1,2,7,8-diepoxyoctane (DEO) for PuragenTM, HA hydrogels were prepared by direct amide bond formation between the carboxyl groups of HA and hexamethylenediamine (HMDA) with an optimized carboxyl group modification for effective tissue augmentation. The HA-HMDA hydrogels could be prepared within 5 min by the addition of HMDA to HA solution activated with 1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide (EDC) and 1-hydroxybenzotriazole mono-hydrate (HOBt). Five kinds of samples, a normal control, a negative control, a positive control of Restylane®, adipic acid dihydrazide grafted HA (HA-ADH) hydrogels, and HA-HMDA hydrogels, were subcutaneously injected to wrinkled model mice. According to the image analysis on dorsal skin augmentation, the HA-HMDA hydrogels exhibited the best tissue augmentation effect being stable for more than 3 months. Furthermore, histological analyses after hematoxylin-eosin (H&E) and Masson’s trichrome staining revealed the excellent biocompatibility and safety of HA-HMDA hydrogels. The dermal thickness and the dermal collagen density in wrinkled mice after treatment with HA-HMDA hydrogels for 12 weeks were comparable to those of normal mice. Compared with HA-DVS hydrogels and Restylane®, the excellent tissue augmentation by HA-HMDA hydrogels might be ascribed to the biocompatible residues of amine groups in the crosslinker of HMDA. The HA-HMDA hydrogels will be investigated further as a novel dermal filler for clinical applications.
In chapter 3, a novel artificial bone substitute composed of MegaGen synthetic bone (MGSB) and HA hydrogels was developed for bone tissue engineering applications. A biphasic calcium phosphate of MGSB was prepared by chemical precipitation method with a porous spherical morphology. On the basis of the fact that HA plays important roles in bone regeneration, and promotes the differentiation, vascularization, and migration of stem cells, HA-Cystamine (CYS) hydrogels with cleavable disulfide linkages were prepared to supply HA continuously for effective bone regeneration by their controlled degradation in vivo. Among seven different samples using Bio-OSS®, MGSB, and/or several kinds of HA hydrogels, MGSB/HA-CYS hydrogels resulted in the most significant bone regeneration in the calvarial critical bone defect of New Zealand white rabbits. Histological and histomorphometric analyses revealed that the bone regeneration by MGSB/HA-CYS hydrogels was as high as 43% occupying 71% of the bone defect area with MGSB in the form of a calvarial bone plate in 4 weeks. After that, MGSB was bioabsorbed and replaced gradually with regenerated bones as observed in 8 weeks. Synchrotron X-ray imaging clearly confirmed the effective bone regeneration by MGSB/HA-CYS hydrogels visualizing 3D micron-scale morphologies of regenerated bones being interconnected with MGSB. In addition, sequential non-destructive synchrotron X-ray tomographic analysis results from anterior to posterior of the samples were well matched with the histomorphometric analysis results. The clinically feasible artificial bone substitutes of MGSB/HA-CYS hydrogels will be investigated further for various bone tissue engineering applications.
In chapter 4, we developed in situ supramolecularly assembled and modularly modified hydrogels for long-term engineered mesenchymal stem cell (eMSC) therapy using cucurbit[6]uril conjugated HA (CB[6]-HA), diaminohexane conjugated HA (DAH-HA), and drug conjugated CB[6] (drug-CB[6]). MSCs were transduced with recombinant adenoviral (rAd) vectors containing EGFP or IL-12M producing genes (EGFP/rAd or IL-12M/rAd vectors) after making a complex with Fe3+. The transgene expression of encapsulated cells was promoted by the controlled release of dexamethasone (Dexa) and retinoic acid (RA) from the hydrogels. The efficient in vitro transgene expression of eMSCs in supramolecular HA hydrogels was confirmed from the enhanced green fluorescence protein (EGFP) and interleukin-12 (IL-12M) levels in the presence of Dexa and/or RA. The eMSCs producing EGFP remained alive and emitted the fluorescence within CB[6]/DAH-HA hydrogels in mice for more than 60 days. Furthermore, the long-term expression of mutant IL-12M by eMSCs within the supramolecular hydrogels resulted in effective inhibition of tumor growth with a significantly enhanced survival rate. Taken together, these findings confirm the feasibility of supramolecular hydrogels as 3D artificial ECMs for cell therapies and tissue engineering applications.
In summary, HA hydrogels were successfully developed for soft and hard tissue engineering applications. HA hydrogels with long-term stability were adequate for dermal filler applications and HA hydrogels with cleavable disulfide linkages for rapid degradation were effectively applied for bone regeneration. These hydrogels are being investigated further for clinical applications. Moreover, in situ supramolecularly assembled and modularly modified HA hydrogels were developed for the long-term survival and prolonged transgene expression of bioengineered MSCs, which can be utilized as a platform scaffold for the treatment of cancer and other intractable diseases such as stroke and limb ischemia as well as cancer. We believe that this work will contribute greatly to the field of hydrogels which are definitely necessary to establish a new era for stem cell therapies and tissue engineering applications.