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저자정보
Lan Phuong Nguyen (Korea University College of Medicine) Huong Thi Nguyen (Korea University College of Medicine) 용효정 (고려대학교) Arfaxad Reyes-Alcaraz (University of Houston) Yoo-Na Lee (Korea University College of Medicine) Hee-Kyung Park (Korea University College of Medicine) Yun Hee Na (Korea University College of Medicine) 이철순 (고려대학교의료원) Byung-Joo Ham (고려대학교) Jae Young Seong (고려대학교) 황종익 (고려대학교)
저널정보
한국분자세포생물학회 Molecules and Cells Molecules and Cells 제43권 제11호
발행연도
2020.1
수록면
909 - 920 (12page)

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Cytosolic Ca2+ levels ([Ca2+]c) change dynamically in response to inducers, repressors, and physiological conditions, and aberrant [Ca2+]c concentration regulation is associated with cancer, heart failure, and diabetes. Therefore, [Ca2+]c is considered as a good indicator of physiological and pathological cellular responses, and is a crucial biomarker for drug discovery. A genetically encoded calcium indicator (GECI) was recently developed to measure [Ca2+]c in single cells and animal models. GECI have some advantages over chemically synthesized indicators, although they also have some drawbacks such as poor signal-to-noise ratio (SNR), low positive signal, delayed response, artifactual responses due to protein overexpression, and expensive detection equipment. Here, we developed an indicator based on interactions between Ca2+-loaded calmodulin and target proteins, and generated an innovative GECI sensor using split nano-luciferase (Nluc) fragments to detect changes in [Ca2+]c. Stimulation-dependent luciferase activities were optimized by combining large and small subunits of Nluc binary technology (NanoBiT, LgBiT:SmBiT) fusion proteins and regulating the receptor expression levels. We constructed the binary [Ca2+]c sensors using a multicistronic expression system in a single vector linked via the internal ribosome entry site (IRES), and examined the detection efficiencies. Promoter optimization studies indicated that promoter-dependent protein expression levels were crucial to optimize SNR and sensitivity. This novel [Ca2+]c assay has high SNR and sensitivity, is easy to use, suitable for high-throughput assays, and may be useful to detect [Ca2+]c in single cells and animal models.
#calmodulin #cytosolic Ca2+ sensor #internal ribosome entry site #myosin light chainC kinase 1/2 #NanoBiT assay

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Bluthgen, N. / 2017 / Profiling the MAPK/ERK dependent and independent activity regulated transcriptional programs in the murine hippocampus in vivo / Sci. Rep 7:45101 google schola Charlton, S. J. / 2010 / Elusive equilibrium : the challenge of interpreting receptor pharmacology using calcium assays / Br. J. Pharmacol 161:1250~1265 google schola Cho, J. H. / 2017 / The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators / ACS Chem. Biol 12:1066~1074 google schola Conklin, B. R. / 1993 / Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gq alpha to that of Gi alpha / Nature 363:274~276 google schola Cui, C. / 2017 / Targeting calcium signaling in cancer therapy / Acta Pharm. Sin. B 7:3~17 google schola

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