현재 국내 감자재배 및 씨감자 생산과정에 심각한 피해를 주고 있는 감자잎말림바이러스(PLRV)의 정밀진단을 위해 digoxigenin(DIG)으로 표지된 cRNA 프로브를 이용하여 진단을 실시하였다. Transcription 전용 vector인 pSPT18에 sub cloning된 0.6 kb 크기의 PLRV coat protein 유전자를 주형으로 DIG가 표지된 프로브를 합성하였다. 프로브를 표지한 DIG에 반응하는 최종 기질의 종류에 따라 막에서 직접 발색시키거나 X-ray film을 감광시켜 진단하는 방법을 사용하였다. 막에 직접 발색시키기 위해 NBT를 반응기질로 사용하였으며, X-ray 필름을 감광시키기 위해서는 CSPD를 각각 사용하였다. 또한 잎에서 바이러스 핵산이 포함된 total RNA의 수율을 높이기 위한 최적 완충용액의 조성을 확인하기 위해 기존 보고된 여러 문헌들을 참고하여 조성된 추출완충용액을 사용하여 추출물의 진단 효율을 확인한 결과 AMES buffer가 본 실험 조건에 가장 유리한 것으로 확인되었다. 이러한 방법을 이용해 100 ㎎의 감자 잎조직에서 total RNA를 추출하여 진단에 이용해본 결과 반응기질의 종류와 상관없이 1/32배의 희석배수에서 RNase 제거를 위한 특별한 처리 없이도 PLRV의 진단이 가능하였다.
Digoxigenin (DIG) was used to prepare nucleic acid probe for the detection of RNA of potato leafroll virus (PLRV) in the potato leaf extracts. The 0.6 kb coat protein (CP) gene cDNA of PLRV in plasmid pSPT18 vector was labeled with digoxigenin by in vitro run-off transcription and then used for cRNA probe. In the several buffers tested for increase the total RNA extraction efficiency AMES buffer was the most suitable for this detection method. The RNA extracts from potato leaves shown symptoms of PLRV were dot blotted onto nylon membrane and hybridized with labeled RNA probes. After hybridization, labeled RNA bound to PLRV RNA on membrane was detected with anti-digoxigenin alkaline phosphatase. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium (NBT) salt and CSPD were used as substrate for colorimetric and film exposure detection, respectively. These detection methods were very sensitive allowing for detection of 1/32 diluted total RNA extract from 100 ㎎ leaf tissue.